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發(fā)布時間：2021-04-07 23:09 人氣： 來源：
一、病菌、黃曲霉菌和酵母菌計數(shù)
１ 概述
病菌、黃曲霉菌和酵母菌計數(shù)是檢驗非要求殺菌中藥制劑及原、輔材受微生物菌種環(huán)境污染水平的方式。也是用以點評制造業(yè)企業(yè)的藥用價值原材料、輔材、機器設(shè)備、器材、生產(chǎn)流程、自然環(huán)境和作業(yè)者的衛(wèi)生條件的關(guān)鍵方式和根據(jù)。
病菌、黃曲霉菌和酵母菌計數(shù)均選用平板菌落計數(shù)法，它是活菌記數(shù)的方式之一，也是現(xiàn)階段國際性上很多我國常見的一種方式。以在瓊脂平板上的病菌、黃曲霉菌和酵母產(chǎn)生一個單獨由此可見的菌落為記數(shù)根據(jù)。該測定方法結(jié)果只體現(xiàn)在該要求標(biāo)準(zhǔn)下所生長發(fā)育的病菌（為一群嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌）、黃曲霉菌和酵母的菌落數(shù)。不包括對營養(yǎng)成分、co2、溫度、pH和別的要素有特別要求的病菌、黃曲霉菌和酵母。
一個病菌、黃曲霉菌和酵母的菌落均可由一個或好幾個菌細(xì)胞生長繁育而成。因而供試品中所測出的菌落數(shù)，具體為菌落產(chǎn)生企業(yè)數(shù)（colony forming unity，cfu），不可了解為病菌、黃曲霉菌、酵母的數(shù)量。
2 機器設(shè)備、儀器設(shè)備
2.1 機器設(shè)備
2.1.1 清潔試驗室
微生物限度查驗應(yīng)該有獨立的清潔試驗室，每一個清潔試驗室應(yīng)該有單獨的凈化室內(nèi)空氣系統(tǒng)軟件。
2.1.1.1 構(gòu)造和規(guī)定 清潔試驗室應(yīng)光照優(yōu)良、防止?jié)窭?、避開洗手間及污染。操作室與緩沖間中間應(yīng)該有試品傳送艙，進(jìn)出操作室和緩沖間的門不可直對。清潔試驗室內(nèi)要六面光潔整平，能承受清理消毒殺菌。墻面與路面、吊頂天花板相接處應(yīng)呈凹弧型，無間隙，不留死角。操作室內(nèi)不可安裝下水管道。
清潔試驗室內(nèi)的照明燈具應(yīng)嵌裝在吊頂天花板內(nèi)，房間內(nèi)陽光照射應(yīng)遍布勻稱，光照強度不少于300LX。
2.1.1.2 溫度、環(huán)境濕度 清潔試驗室內(nèi)的溫度應(yīng)操縱在18～26℃，空氣濕度最好是在40％～60％。
2.1.1.3 操作室 操作室應(yīng)安裝空氣除菌過慮層.流設(shè)備。潔凈度等級不可小于10000級，部分潔凈度等級為100級（或置放同級別超凈工作臺）。操作室或超凈工作臺的清潔氣體應(yīng)維持對自然環(huán)境產(chǎn)生正壓力，不少于10Pa，操作室與緩沖間也應(yīng)維持相對性正壓力，不少于5Pa。實際操作臺子上常備藥品天平秤，酒精燈，火柴棍，酒精藥棉，大、小橡皮乳房等。
2.1.1.4 緩沖間 緩沖間內(nèi)要有洗臉盆和無菌檢測衣、帽、防護口罩、腳套等。
2.1.1.5 清潔等級及查驗方式 一般 選用細(xì)顆粒物數(shù)及落菌數(shù)或沉降菌數(shù)測定方法（參考《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室》（區(qū)）飄浮顆粒、落菌、和沉降菌的測試標(biāo)準(zhǔn)》的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)）開展?jié)崈舳鹊燃壵J(rèn)證。
不一樣清潔等級的粒子、落菌和沉降菌規(guī)范見下表1。
表l 不一樣清潔等級的粒子、落菌和沉降菌規(guī)范
| 清潔等級 |
浮塵數(shù)ㄍm3 |
落菌（個）ㄍm3 |
沉降菌（個）ㄍ （φ90mm?0.5h） |
|
| 粒子直徑≥0.5μm |
粒子直徑≥5μm |
|||
| 100級 |
≤3，500 |
≤0 |
≤5 |
≤1 |
| 10000級 |
≤350，000 |
≤2000 |
≤100 |
≤3 |
| 100000級 |
≤3，500，000 |
≤20，000 |
≤500 |
≤10 |
沉降菌數(shù)測量（Ⅱ法）
清潔試驗室工作臺消毒殺菌擦洗解決后，先運行層流凈化設(shè)備30min，將備妥的營養(yǎng)成分瓊脂平板3個（經(jīng)30～35℃預(yù)培養(yǎng)48h，證實無菌落生長發(fā)育）。以無菌檢測方法（或經(jīng)傳送箱）移人操作室，置凈化臺左、中、右各一個，打開表蓋，曝露30min后將蓋上上。在30～35℃培養(yǎng)箱里顛倒培養(yǎng)48h，取下查驗。3個平板生長發(fā)育的均值菌落數(shù)不超過一個。
有標(biāo)準(zhǔn)的企業(yè)，另外應(yīng)查驗清潔操作室和超凈工作臺上的落菌和粒子數(shù)。
實際操作問和超凈工作臺要按時檢驗其潔凈度等級，各自應(yīng)做到10000級和100級。如菌落數(shù)或粒子數(shù)超標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)清理過濾裝置中的過慮設(shè)備，必需時給予拆換。
2.1.1.6 在每一次操作之前、完用0.1％苯扎溴銨水溶液或別的適合消毒劑擦洗工作臺及很有可能環(huán)境污染的盲區(qū)，隨后運行層流凈化設(shè)備。
2.1.2 陽性菌試驗室
涉及到試驗室監(jiān)管菌種的分離出來評定、試品呈陽性菌種的分離出來剖析、方式認(rèn)證實驗中的陽性菌實際操作等試驗主題活動，應(yīng)在專業(yè)的陽性菌試驗室開展。除另有要求外，陽性菌試驗室應(yīng)符合我國Ⅱ級院內(nèi)感染規(guī)范，陽性菌試驗室應(yīng)配置生物安全柜。陽性菌實際操作不可在供試品檢測用清潔試驗室內(nèi)開展。
2.1.3 清潔試驗室、陽性菌試驗室與刷洗、殺菌、消毒殺菌、培養(yǎng)及結(jié)果觀查的工作中間等設(shè)備應(yīng)相對性集中化，合理布局，防止環(huán)境污染，方便管理。
2.2 儀器設(shè)備
2.2.1 控溫培養(yǎng)箱（30～35℃）、生物化學(xué)培養(yǎng)箱（23～28℃）、微波爐加熱、勻漿儀（3000～8000 r／min）或康氏震蕩器、恒溫水浴槽、電熱干燥箱（100～300℃）、家用冰箱、離心脫水機、離心管、微孔濾膜及薄膜過濾器、滅菌設(shè)備（應(yīng)用時要開展殺菌實際效果查驗并應(yīng)按時請相關(guān)部門計量檢定）。
菌落電子計數(shù)器、光學(xué)顯微鏡（40×～1500×）、電子分析天平或藥品天平秤（感量0.1g），pH計。
2.2.2 玻璃容器 錐形瓶（250～300ml、500毫升內(nèi)裝玻璃彈珠多個）、培養(yǎng)皿（9cm）、量筒（100ml，1000m1）、試管嬰兒（20mm×180mm）及塞、塑料吸管（1米一分度0.0l，十米一分度0.1）、注射針（20ml或30m1）、涂布棒、注射器頭、蓋玻片、蓋玻片、夾層玻璃消毒殺菌缸（有蓋）、不銹鋼湯桶（有蓋）。玻璃容器用前應(yīng)清洗整潔，塑料吸管、量筒不掛水珠，沒有殘留抑菌化學(xué)物質(zhì)。塑料吸管口上方距0.5厘米處塞進(jìn)約2cm的適合松散棉絮，置塑料吸管筒內(nèi)或牛皮紙包裝袋中。錐形瓶、量筒、試管嬰兒均需加棉塞或硅膠塞，若用震蕩器制取混懸液時，尚要用玻璃貼紙包囊瓶蓋，以防震蕩時供標(biāo)準(zhǔn)溶液環(huán)境污染瓶蓋，再用包裝紙捆扎。玻璃容器，均于160℃干熱滅菌1h或髙壓蒸汽121℃滅菌30min，烘干備用。
2.2.3 用品 大、小橡皮乳房（放于整潔有蓋的器皿中，并應(yīng)按時用70％～75％乙醇溶液泡浸）。無菌檢測衣、帽、防護口罩、膠手套（清洗后配套設(shè)施，用包裝紙包嚴(yán)）滅菌，備用。也可以用一次性無菌檢測衣、帽、防護口罩、膠手套。
接種環(huán)（白銥金或鎳鉻，環(huán)徑4～5毫米、長短6～10厘米）、酒精燈、酒精藥棉或碘伏棉球、滅菌剪子或滅菌手術(shù)刀片和滅菌醫(yī)用鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹鋼板藥匙、試管架、火柴棍、油性記號筆、白釉盤、洗臉盆、陶瓦蓋（12厘米）、試驗記錄紙等。
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、油漆稀釋劑和實驗試劑
3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液
3.1.1 0.1％苯扎溴銨水溶液或別的適合消毒劑（供洗手消毒、擦洗實際操作櫥柜臺面用）。
3.1.2 5％石碳酸水溶液（選好后裝進(jìn)夾層玻璃消毒殺菌主缸，供消毒殺菌細(xì)菌很多塑料吸管用）也可以采用別的適合消毒劑。
3.1.3 75％乙醇溶液。
3.1.4 碘酊或碘伏消毒液水溶液。
3.2 油漆稀釋劑和實驗試劑
油漆稀釋劑配置后，選用髙壓蒸汽滅菌法滅菌。
3.2.1 0.9％無菌檢測氯化鈉溶液（配件二3.1）。
3.2.2 pH7.0無菌檢測氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液（配件二3.5）。
3.2.3 無菌檢測聚山梨酯80氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液（配件二3.4）。
3.2.4 pH6.8無菌檢測聚磷酸鹽緩沖溶液、pH7.6無菌檢測聚磷酸鹽緩沖溶液（配件二3.3）。
3.2.5 無菌檢測聚山梨酯80氯化鈉溶液（配件二3.2）。
3.2.6 無菌檢測0.1％鈦酸異丙酯三苯四氮唑水溶液（TTC）（配件二2.15）。
3.2.7 pH7.2無菌檢測聚磷酸鹽緩沖溶液（配件二3.3）。
4 培養(yǎng)液
4.1 營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.2）。
4.2 玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.4）。
4.3 酵母菌浸取粉胨葡萄糖水（YPD）瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.5）。
培養(yǎng)液制取常見問題：
4.3.1 選用干躁培養(yǎng)液，按表明配置，解決滅菌后的培養(yǎng)液pH開展校檢。若為自制培養(yǎng)液，原材料應(yīng)選擇，瓊脂凝結(jié)力應(yīng)測量，以明確配置時瓊脂使用量。實驗試劑規(guī)格型號應(yīng)是化學(xué)純之上。
4.3.2 配置的培養(yǎng)液不應(yīng)該有沉積。若有沉積，應(yīng)于融化后趁熱過濾，滅菌后應(yīng)用。
4.3.3 培養(yǎng)液的散裝量不可超出器皿的2／3，以防滅菌時外溢。包裝時，瓶塞務(wù)必塞緊，以防松脫或掉下來導(dǎo)致染菌。
4.3.4 培養(yǎng)液配置后應(yīng)在1h內(nèi)滅菌，防止細(xì)菌繁殖。
4.3.5 滅菌后的培養(yǎng)液應(yīng)儲存在2～25℃，避免 被環(huán)境污染，可在3個星期內(nèi)用畢；儲存于密閉式器皿中，可在一年內(nèi)應(yīng)用。制取好的培養(yǎng)液置放時間不適合太長，以防水份流失及染菌。
4.3.6 宜選用用水浴或微波爐熔融瓊脂培養(yǎng)液，勿用加熱爐立即熔融瓊脂培養(yǎng)液，以防營養(yǎng)成分成分過多遇熱而毀壞。已熔融的培養(yǎng)液應(yīng)8h內(nèi)一次用完，剩下培養(yǎng)液不適合再用。
4.4 培養(yǎng)液適用范圍試驗的規(guī)定及實際操作見本安全操作規(guī)程第三一部分。
5 供試品取樣、儲存及檢測量
5.1 取樣
5.1.1 一般選用簡單隨機抽樣方式，其取樣量應(yīng)是檢測使用量（兩個之上最少包裝企業(yè)）的3～5倍量（以便考研復(fù)試或備用觀查）。
5.1.2 取樣時，凡發(fā)覺有出現(xiàn)異?；虍惓５脑嚻罚瑧?yīng)選擇有疑問的試品。機械設(shè)備損害、顯著裂開的包裝不可做為試品。
5.1.3 凡能從藥物、瓶塞（后蓋板里側(cè)及瓶塞周邊）外型看得出長螨、長霉、生蟲及霉變的藥物，可立即判為特采，不用再品質(zhì)檢驗。
5.2 儲存
5.2.1 供試品在檢測以前，應(yīng)儲存在蔭涼干躁處，勿冷凍或冷藏，防止供試品內(nèi)環(huán)境污染菌因儲存標(biāo)準(zhǔn)不當(dāng)之處至死，損害或繁育。
5.2.2 供試品在檢測以前，應(yīng)維持原包裝情況，禁止打開。包裝已打開的試品不可做為供試品開展查驗。
5.3 檢測量
5.3.1 全部制劑的檢測量均需源自兩個之上包裝企業(yè)（中藥材蜜丸需源自4丸、膜劑取4片之上）。
5.3.2 固態(tài)及半固態(tài)（粘稠性供試品）中藥制劑檢測量為20g。
5.3.3 液態(tài)中藥制劑檢測量為10ml。
5.3.4 膜劑除另有要求外，檢測量為100cm2。
5.3.5 獨特珍貴或少量包裝的藥物，檢測量可酌減。除另有要求外，內(nèi)服固態(tài)中藥制劑不少于4g，液態(tài)中藥制劑選用源液者不可低于6ml，選用供標(biāo)準(zhǔn)溶液者不可低于3Ml，外敷藥物不可低于5G。
規(guī)定查驗沙門氏菌的供試品，其檢測量應(yīng)提升40g或20ml（在其中20g或10ml用以陽性對照實驗）。
6 實驗提前準(zhǔn)備
6.1 將供樣品及全部已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管嬰兒、塑料吸管（1ml、十米1）、量筒、油漆稀釋劑等挪到清潔試驗室內(nèi)。每一次實驗常用物件務(wù)必事前搞好方案，提前準(zhǔn)備充足使用量，防止實際操作中進(jìn)出清潔試驗室。序號后將所有外包裝盒（包裝紙）除掉。
6.2 打開清潔試驗室氣體過濾系統(tǒng)，并使其工作中不少于30min。
6.3 實際操作工作人員用香皂或適合消毒液洗手，進(jìn)到緩沖間，換勞保鞋。再用0.1％苯扎溴銨水溶液或別的消毒液洗手或用酒精棉擦手，配戴無菌檢測衣、帽、防護口罩、膠手套。
6.4 操作之前先用酒精藥棉擦手，再用碘伏棉球（也可以用酒精藥棉）擦洗供試品瓶、盒、袋等的接口處周邊，待干后用滅菌的手術(shù)治療鑷或剪將供試品啟封。
7 供標(biāo)準(zhǔn)溶液的制取
依據(jù)供試品的物理化學(xué)特點與生長習(xí)性，采用適合的方式制取供標(biāo)準(zhǔn)溶液。常用破乳劑，增稠劑、還原劑或消滅劑以及使用量應(yīng)證實是合理的，并對微生物菌種不含毒性。供標(biāo)準(zhǔn)溶液的制取若要用水浴加溫時，溫度不可超出45℃，時間不可超出30min。除另有要求外，常見的供試品制取方式以下：
7.1 液態(tài)供試品 取供樣品10ml，加pH7.0無菌檢測氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液至100ml，攪拌，做為供標(biāo)準(zhǔn)溶液。除油劑可添加適量的無菌檢測聚山梨酯80使供樣品分散化勻稱。水溶液態(tài)中藥制劑可以用混和的供試品源液做為供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.2 固態(tài)、半固態(tài)或粘稠液供試品 取供樣品20g，加pH7.0無菌檢測氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液至100ml，用勻漿儀或別的適合的方式，攪拌，做為供標(biāo)準(zhǔn)溶液。必需時加適當(dāng)?shù)臒o菌檢測聚山梨酯80，并置水浴中適度升溫使供樣品分散化勻稱。
7.3 非水溶供試品
7.3.1 乳膏、乳膏藥 取供樣品5G（或5m1），加至含融化的（溫度不超過45℃）司盤805G、單聚醚甘油酯4g、聚山梨酯8010g的無菌檢測化合物（融化，溫度不超過45℃）的量杯中，即先將量杯中無菌檢測助有機溶劑化合物融化，待溫度不超過45℃時，添加供試品，用無菌檢測玻棒拌和結(jié)團后，分次漸漸地添加45℃的pH7.0無菌檢測氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液至100ml，邊加邊拌和，使供樣品充足乳狀液，做為1:20供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.3.2 除油劑 取供樣品10ml，添加無菌檢測聚山梨酯80 5～8米l，混勻，再添加油漆稀釋劑至100ml，做為1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.3.3 栓劑 稱量供試品20g，置滅菌錐形瓶中，加適當(dāng)油漆稀釋劑，置45℃水浴隔熱保溫10min，使溶，添加無菌檢測聚山梨酯80 5～8米l，振搖使之乳狀液，再加油漆稀釋劑（油漆稀釋劑和聚山梨酯80總產(chǎn)量為100m1），混勻，做為1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.3.4 膏藥 取供樣品20g，加至含20ml無菌檢測十四烷酸異丙酯（制作方法見附則ⅪH“無菌檢測檢測法”)和無菌檢測玻璃彈珠的適合器皿中，必需時可提升十四烷酸異丙酯的使用量，充足振搖，使供樣品融解。隨后添加45℃的pH7.0無菌檢測氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液100m1，振搖5～10min，提純，待水油顯著分層次，取其隔水層做為1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.4 非水溶膜劑供試品 一般抽樣為100cm2，置滅菌錐形瓶中，添加適量的pH7.0無菌檢測氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液，于45℃±1℃水浴中隔熱保溫，泡浸，振搖，以供試品浸液做為l:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。中藥材膜劑取100cm2，剪下來，加適當(dāng)?shù)膒H7.0無菌檢測氧化鈉?蛋白胨緩沖溶液（一般 1 cm2加1ml或1m1），泡浸，振搖，以供試品浸液做為1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7．5 腸溶及乙狀結(jié)腸溶中藥制劑供試品 取供樣品20g，腸溶中藥制劑加pH6.8無菌檢測聚磷酸鹽緩沖溶液至100ml，乙狀結(jié)腸溶中藥制劑加pH7.6無菌檢測聚磷酸鹽緩沖溶液至100ml，均置45℃水浴中，振搖，使融解，做為1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.6 噴霧劑、噴霧供試品 取規(guī)定量供試品，置電冰箱冷凍室（－20℃下列）內(nèi)約1h。取下，快速消毒殺菌供試品器皿的打開位置周邊，用無菌檢測鋼錐在器皿上鉆一小圓孔，在室內(nèi)溫度輕輕地旋轉(zhuǎn)器皿，使拋射劑慢慢所有釋放。用無菌檢測注射針吸出所有藥水，加至適當(dāng)?shù)挠推嵯♂寗ㄈ艉撬艹煞?，加適當(dāng)?shù)臒o菌檢測聚山梨酯80）中，攪拌，取等同于20g或10ml的供試品，再稀釋液成1:10的供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.7 茶劑供試品 取供樣品20g，置滅菌錐形瓶中，添加油漆稀釋劑100ml，振搖2～3min，以滅菌沙布過慮（若為袋泡茶，可立即取2袋，以稱樣結(jié)果按1:10加油漆稀釋劑，泡浸30min）。
之上供試品如吸濕澎漲，或粘度過高，可提升油漆稀釋劑的量，做成1:20～1:100供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.8 貼膏藥供試品 取規(guī)定量供試品，除掉膏藥的防護層，置放在無菌檢測夾層玻璃或塑料板上，黏貼臉朝上。用適合的無菌檢測多孔結(jié)構(gòu)（如無菌紗布）遮蓋膏藥的黏貼面以防止膏藥黏貼在一起。隨后將其放置適合容積并帶有消滅劑（如聚山梨酯80或大豆卵磷脂）的油漆稀釋劑中，用勁震蕩最少30min，或置放于勻質(zhì)儀勻質(zhì)l0min，或以別的方式制取成供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
7.9 具抗菌特異性的供試品
當(dāng)供試品具備抗菌特異性時，應(yīng)清除供標(biāo)準(zhǔn)溶液的抗菌特異性后，再依規(guī)查驗。常見的方式以下：
7.9.1 稀釋液法 取規(guī)定量的供標(biāo)準(zhǔn)溶液，加至較很多的培養(yǎng)液中，使企業(yè)容積內(nèi)的供試品成分降低至沒有殺菌作用。用平板電腦測定方法菌數(shù)時，1ml供標(biāo)準(zhǔn)溶液可相等分注好幾個平皿；操縱菌查驗時，可增加增菌培養(yǎng)液的使用量。培養(yǎng)液稀釋液法適用殺菌作用較弱的中藥制劑。
7.9.2 抽濾離子交換法 此方式用以除去供標(biāo)準(zhǔn)溶液中的沉淀，針對抗菌特異性極強的供試品，如供標(biāo)準(zhǔn)溶液中有不溶顆粒物、沉積，取供標(biāo)準(zhǔn)溶液，先以500 r／min，抽濾3min，取上清液開展實驗，此方式用以病菌記數(shù)和操縱菌（病菌）查驗。
7.9.3 塑料薄膜過濾法 見細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)。
7.9.4 中合法 凡含汞、砷或添加劑的供試品，可以用相對應(yīng)的實驗試劑鈍化處理、中合其抗菌特異性，做成供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
8 供標(biāo)準(zhǔn)溶液的釋?。?0倍增長稀釋液法）
8.1 取2～3支殺菌試管嬰兒，各自添加8ml pH7.0氧化鈉－蛋白胨緩沖溶液殺菌油漆稀釋劑（這時實際操作一般為：右手執(zhí)試管嬰兒并將塞開啟，歪斜，左手執(zhí)10ml塑料吸管吸量。切忌在酒精噴燈火苗的上方實際操作，以防火苗將供標(biāo)準(zhǔn)溶液中的菌體細(xì)胞消滅）。加油漆稀釋劑后，試管嬰兒塞應(yīng)該馬上塞外。
8.2 另取1支1ml殺菌塑料吸管吸1:10勻稱供標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，添加配有8ml pH7.0氧化鈉－蛋白胨緩沖溶液殺菌油漆稀釋劑的試管嬰兒中，攪拌，即得1:100供標(biāo)準(zhǔn)溶液。依此類推，依據(jù)供試品環(huán)境污染水平，可稀釋液至1:103、1:104等適合稀釋液級。每增長l稀釋液級，務(wù)必另換一支塑料吸管。
稀釋液時，塑料吸管插進(jìn)第1級封閉液內(nèi)不少于液位2.5厘米，不斷吸吹約10次。吸液管時，應(yīng)多吸至高過塑料吸管上端標(biāo)尺少量，隨后提到塑料吸管，貼到試管嬰兒內(nèi)腔調(diào)節(jié)水率至標(biāo)尺，塑料吸管挪到第二級稀釋液管的內(nèi)腔近液位處（勿觸碰液位）遲緩地釋放所有供標(biāo)準(zhǔn)溶液（塑料吸管內(nèi)要無粘附或殘余液態(tài)），隨后將塑料吸管放進(jìn)消毒劑主缸。
9 記數(shù)方式認(rèn)證
因為一些供試品具備抑菌特異性，在創(chuàng)建測定法或原測定方法的檢測標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生改變時，很有可能危害檢測結(jié)果的精確性，務(wù)必對供樣品的抗菌特異性及測定法的穩(wěn)定性開展認(rèn)證。對各實驗菌的利用率應(yīng)逐一開展認(rèn)證。
9.1 認(rèn)證用菌種大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102]，橙黃色鏈球菌Staphylococcus aureus[CCMCC(B) 26003]，枯草枯草芽孢菌Bacillus subtilis[CMCC(B) 63501]，白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001]，黑曲霉菌Aspergillus niger[CMCC(F) 98003]。
菌液制取 打疫苗大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、枯草枯草芽孢菌的新鮮塑造物至營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液中或營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液上，塑造18～24小時；打疫苗白色念珠菌的新鮮塑造物至改進(jìn)喬治培養(yǎng)液中或改進(jìn)喬治瓊脂培養(yǎng)液上，塑造24～48h。以上塑造物用0.9％無菌檢測氯化鈉溶液做成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。打疫苗黑曲霉的新鮮塑造物至改進(jìn)喬治瓊脂斜坡培養(yǎng)液上，塑造5～7天，添加3～5ml含0.05％（ml／m1）聚山梨酯80的0.9％無菌檢測氯化鈉溶液，將胞子過柱。隨后，用適合方式吸出胞子懸液至無菌檢測試管嬰兒內(nèi)，用含0.05％（ml／ml）聚山梨酯80的0.9％無菌檢測氯化鈉溶液做成每1ml含胞子數(shù)50～l00cfu的胞子懸液。
菌懸液制取后，若在室內(nèi)溫度下置放應(yīng)在1h內(nèi)應(yīng)用，若儲存在2～8℃的菌懸液能夠 在24小時內(nèi)應(yīng)用。黑曲霉菌的胞子懸液儲存在2～8℃，可在認(rèn)證過的儲存期內(nèi)取代相匹配量的新鮮胞子懸液應(yīng)用。
9.2 認(rèn)證方式 認(rèn)證實驗分4組，最少應(yīng)開展3次單獨的平行面實驗，并各自測算供試品組和對照實驗實驗的菌利用率。
9.2.1 供試品組 取最少稀釋液級的供標(biāo)準(zhǔn)溶液，按每1ml供標(biāo)準(zhǔn)溶液添加50～l00cfu實驗菌，按菌落計數(shù)方式測量其菌數(shù)。平皿法記數(shù)時，取實驗菌液、供標(biāo)準(zhǔn)溶液各1ml各自引入平皿中，馬上竭盡瓊脂培養(yǎng)液；塑料薄膜過濾法記數(shù)時，取供標(biāo)準(zhǔn)溶液2ml過慮，清洗液清洗，并在最后一次的清洗液中添加實驗菌。
9.2.2 活菌組 取以上實驗菌液，測量其添加的實驗菌菌數(shù)。
9.2.3 供試品對照實驗 取最少稀釋液級的供標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，按菌落計數(shù)方式測量供試品本底菌數(shù)。
9.2.4 油漆稀釋劑對照實驗 為調(diào)查供標(biāo)準(zhǔn)溶液制取全過程中對微生物菌種危害的水平，可以用相對應(yīng)的封閉液取代供試品，添加實驗菌，使最后菌濃度值為每1ml含50～l00cfu，按供試品組的供標(biāo)準(zhǔn)溶液制取方式和菌落計數(shù)方式測量其菌數(shù)。
9.3 結(jié)果判斷對照實驗的菌利用率均應(yīng)不少于70％。若供試品組的菌利用率均不少于70％，則可按該供標(biāo)準(zhǔn)溶液制取方式和菌落計數(shù)測定方法供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母數(shù)；若任一次實驗中供試品組的菌利用率小于70％，應(yīng)創(chuàng)建新的方式，清除供試品的抗菌特異性，并再次認(rèn)證。
9.4 認(rèn)證實驗可與供試品的細(xì)菌，霉菌及酵母菌計數(shù)另外開展。
9.5 常見問題
9.5.1 常用規(guī)范菌苗的傳代頻次不可超出5代。以低溫干燥的初始菌苗打開后轉(zhuǎn)種塑造，其塑造物為第一代。
9.5.2 黑曲霉菌的菌液制取 將黑曲霉菌打疫苗至改進(jìn)喬治瓊脂斜坡培養(yǎng)液上，于20～25℃塑造5～7天，使很多的胞子造成。添加3～5ml含0.05％（ml／m1）聚山梨酯80的0.9％無菌檢測氯化鈉溶液，用無菌檢測玻棒或接種環(huán)輕輕地將胞子過柱。隨后可以用一支l0ml無菌檢測球型孔狀塑料吸管，其支管用無菌檢測棉絮或沙布捆扎且能過慮真菌的設(shè)備，吸出胞子懸液至無菌檢測試管嬰兒內(nèi)，將胞子懸液稀釋液至1ml含50～l00cfu。
9.5.3 做實驗菌的利用率實驗時，添加菌量50～l00cfu為宜。加菌量太多，如塑料薄膜法，菌體擁堵，則不太好記數(shù)；加菌量偏少，則差值很大。
9.5.4 開展認(rèn)證實驗時，若因沒有適合的方式清除供試品中的殺菌作用而造成微生物菌種收購 的不成功，應(yīng)選用能使微生物菌種生長發(fā)育的高些稀釋液級供標(biāo)準(zhǔn)溶液開展方式認(rèn)證實驗。這時高些稀釋液級供標(biāo)準(zhǔn)溶液的確定要從低往高的稀釋液級開展，但最大稀釋液級供標(biāo)準(zhǔn)溶液挑選應(yīng)依據(jù)供試品應(yīng)合乎的微生物限度規(guī)范和菌數(shù)匯報標(biāo)準(zhǔn)，如供試品應(yīng)合乎的微生物限度規(guī)范是1克細(xì)菌數(shù)不可過1000cfu，那麼最大稀釋液級是1:10?3。
若選用容許的最大稀釋液級供標(biāo)準(zhǔn)溶液開展認(rèn)證實驗還存有一株或多枝實驗菌的利用率達(dá)不上規(guī)定，那麼應(yīng)挑選收購 狀況最貼近規(guī)定的方式開展供試品的檢驗。如某類商品對某實驗菌有極強的抗菌特性，選用塑料薄膜過濾法的利用率為40％，而選用培養(yǎng)液稀釋液法的利用率為30％，那麼應(yīng)挑選塑料薄膜過濾法開展該供樣品的檢驗。在這里狀況下，生產(chǎn)制造企業(yè)或研發(fā)企業(yè)應(yīng)依據(jù)原輔材料的微生物菌種品質(zhì)、生產(chǎn)工藝流程及產(chǎn)品特性開展商品的風(fēng)險評價，以確保檢測方式的穩(wěn)定性，進(jìn)而確保產(chǎn)品品質(zhì)。
10 檢測法
10.1 平皿法
10.1.1 在以上開展10倍增長稀釋液的另外，以該稀釋液級塑料吸管，汲取該稀釋液級供標(biāo)準(zhǔn)溶液各1ml至每一個直徑90mm的殺菌平皿中，或從高稀釋液級至低稀釋液級吸液管時可以用1支塑料吸管吸供標(biāo)準(zhǔn)溶液各1ml至每一個殺菌平皿中。每一稀釋液級每個培養(yǎng)液最少注2～3個平皿（一般為右手執(zhí)平皿，將蓋半閉，左手執(zhí)塑料吸管），注皿時，將1ml供標(biāo)準(zhǔn)溶液漸漸地所有引入平皿中，管中沒有殘留液態(tài)，避免 返流到塑料吸管頂尖部。
10.1.2 陰性對照 待各個封閉液注皿結(jié)束后，用1支1ml塑料吸管汲取實驗用油漆稀釋劑（pH7.0氧化鈉－蛋白胨緩沖溶液）各1ml，各自引入4個平皿中。在其中兩個作細(xì)菌數(shù)陰性對照；另兩個作霉菌、酵母數(shù)陰性對照，如另用YPD瓊脂測量酵母數(shù)時，則再提升兩個平皿作酵母數(shù)陰性對照。
10.1.3 竭盡培養(yǎng)液
將事先配置好的細(xì)菌記數(shù)用的營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液；霉菌、酵母菌計數(shù)用的玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液；含純蜂蜜、王漿液態(tài)中藥制劑用玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液（霉菌）和YPD瓊脂培養(yǎng)液（酵母）熔融，冷至約45℃時，竭盡以上每個平皿約15ml，以順時針方向或反秒針方位迅速轉(zhuǎn)動平皿，使供標(biāo)準(zhǔn)溶液或封閉液與培養(yǎng)液攪拌，蓋上陶瓦蓋，或半蓋上，去除凝結(jié)水后，再移去陶瓦蓋后，蓋上平皿蓋置實際操作服務(wù)平臺上待凝。在轉(zhuǎn)動平皿時切忌將培養(yǎng)液濺到皿邊及皿蓋上。
10.1.4 塑造
細(xì)菌記數(shù)平板電腦倒放置30～35℃恒溫箱中塑造三天。霉菌、酵母菌計數(shù)平板電腦倒放置23～28℃恒溫箱中塑造5天，必需時增加至7天。逐日觀查菌體生長發(fā)育狀況，點計菌體數(shù)。
10.1.5 菌落計數(shù)
10.1.5.1 一般將平板電腦置菌落計數(shù)器上或從平板電腦的反面立即以人眼點計，以散射光襯以深色情況，認(rèn)真觀察。勿漏計細(xì)微的瓊脂層內(nèi)友誼皿邊沿生長發(fā)育的菌體。留意細(xì)菌菌體、霉菌菌體和酵母菌體中間，及其菌體與供試品顆粒物、培養(yǎng)液沉淀、汽泡、液滴等的差別。必需時要高倍放大鏡或用高倍光學(xué)顯微鏡立即觀查，或挑取異常物玻片鏡檢查。
10.1.5.2 供試品如為微生物菌種中藥制劑，應(yīng)將合理微生物菌種菌體清除，不能點計在細(xì)菌、霉菌和酵母數(shù)內(nèi)。清除的方式需按該中藥制劑微生物菌種種類而定，并須觀查菌體特點及上色形狀。
10.1.5.3 供試品封閉液常帶有不可溶原材料、輔材，培養(yǎng)液注皿后亦很有可能造成沉淀，歷經(jīng)塑造后有時候產(chǎn)生總數(shù)許多 的有形化物，且難與菌體相差別。為了更好地有益于菌落計數(shù)，可在實際操作時將適合稀釋液級的供標(biāo)準(zhǔn)溶液多提升注皿（1～兩個平皿）。注皿后不經(jīng)過塑造而置放于電冰箱（勿結(jié)冰）中。在記數(shù)菌體時做為對比。或用含TTC營養(yǎng)成分瓊脂注皿，經(jīng)塑造后該培養(yǎng)液生長發(fā)育的菌體為鮮紅色，襯于白背景上便于點計細(xì)菌菌體和區(qū)別別的有形化物。有一些乳膏等非水溶供試品，經(jīng)營養(yǎng)成分瓊脂注皿后呈奶白色，塑造后生長發(fā)育的菌體不容易分辨和點計，為避免 這類狀況，也可以用含TTC營養(yǎng)成分瓊脂注皿。TTC的使用量要以不抑止微生物菌種生長發(fā)育為宜，一般 應(yīng)用的濃度值為0.001％。
10.1.5.4 若平板電腦上面有兩個或兩個之上菌體重合，人眼可鑒別時仍以兩個或兩個之上菌落計數(shù)；若平板電腦生長發(fā)育有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或塊狀、云霧繚繞狀菌體，菌體間無顯著界限，一條鏈、片做為一個菌體計，但若鏈、上面發(fā)生特性與鏈、塊狀菌體不一樣的分得清菌體時，仍應(yīng)各自記數(shù)，若生長發(fā)育擴散的很大的塊狀菌體或斑點樣菌體，其邊緣有多個特性類似的單獨菌體，一般不適合做為記數(shù)用。
10.1.5.5 菌體生長發(fā)育呈擴散發(fā)展趨勢者，細(xì)菌需要在24小時，霉菌需要在48h做基本點計（點計霉菌菌體時，輕輕地旋轉(zhuǎn)平板電腦，勿不斷旋轉(zhuǎn)，不然使初期產(chǎn)生的胞子撒落在平板電腦的別的位置，又萌發(fā)新的霉菌菌體，造成記數(shù)差值）。
10.1.5.6 在塑造三天點計細(xì)菌，塑造5天點計霉菌時，如菌體很小，不容易分辨，細(xì)菌記數(shù)能延長塑造時間至5天；霉菌及酵母菌計數(shù)能延長塑造時間至7天，再點計菌體數(shù)。
10.1.5.7 對有質(zhì)疑的供試品以YPD培養(yǎng)液作酵母菌計數(shù)時，可塑造至1周再點計菌體數(shù)。
10.1.5.8 含純蜂蜜、王漿液態(tài)中藥制劑用玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液點計霉菌數(shù)，YPD瓊脂培養(yǎng)液點計酵母數(shù)。二者合拼記數(shù)。
10.1.5.9 在特殊情況下，若營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液上起有霉菌和酵母、玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液上起有細(xì)菌，則應(yīng)各自點計霉菌和酵母、細(xì)菌菌體數(shù)。隨后將營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液上的霉菌和酵母數(shù)或玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液上的細(xì)菌數(shù)，與玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液中的霉菌和酵母數(shù)或營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液中的細(xì)菌數(shù)開展較為，以菌體數(shù)大的培養(yǎng)液中的菌數(shù)為記數(shù)結(jié)果。
10.1.6 菌數(shù)匯報標(biāo)準(zhǔn)
10.1.6.1 宜選擇細(xì)菌、酵母均值菌體數(shù)低于300cfu、霉菌菌體數(shù)平均值低于100cfu的平板電腦記數(shù)做為菌數(shù)匯報（取倆位有效數(shù)字）的根據(jù)。
10.1.6.2 當(dāng)僅有一個稀釋液級的菌體數(shù)合乎以上要求，以該級的均值菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告菌數(shù)；當(dāng)有2個或2個之上油漆稀釋劑的菌落數(shù)合乎以上要求，以最大的均值菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)值的值報告。
10.1.6.3 如各稀釋液級的平板電腦均無菌落生長發(fā)育，或僅最少稀釋液級的平板電腦有菌落生長發(fā)育，但均值茵落數(shù)低于1時，以低于1乘以最少稀釋倍數(shù)報告菌數(shù)。
菌數(shù)報告標(biāo)準(zhǔn)實例見下表2。
表2 菌數(shù)報告標(biāo)準(zhǔn)實例
| 菌數(shù)報告 標(biāo)準(zhǔn)實例 |
各稀釋液級（供標(biāo)準(zhǔn)溶液1mlㄍ皿）均值菌落記數(shù)（cfu） |
菌數(shù)報告數(shù) （cfuㄍg，ml，10cm2） |
|||
| 源液 |
1:10（－1） |
1:102（－2） |
1:103（－3） |
||
| 1 |
―― |
64 |
8 |
2 |
640 |
| 2 |
―― |
420 |
64 |
8 |
6400 |
| 3 |
―― |
不能計 |
420 |
64 |
64000 |
| 4 |
―― |
0 |
0.5 |
0 |
＜100 |
| 5 |
―― |
―― |
0 |
0 |
＜100 |
| 6 |
―― |
0 |
0 |
0 |
＜10 |
| 7 |
0 |
0 |
0 |
―― |
＜1 |
10.2 塑料薄膜過濾法
10.2.1 塑料薄膜過濾法關(guān)鍵具有聚集微生物菌種、分離出來除去試品中對微生物菌種生長發(fā)育造成影響的要素的功效，能夠 合理提升 查驗結(jié)果的敏感度和穩(wěn)定性，是近些年微生物菌種查驗行業(yè)中日益廣泛運用的一種方式方法。
10.2.2 塑料薄膜過濾法選用的濾膜孔徑應(yīng)不超0.45um。濾紙直徑一般為50毫米，為以便記數(shù)，及其緩解供標(biāo)準(zhǔn)溶液阻塞濾紙的狀況，在以便實際操作的前提條件下，能夠 采用直徑更高的濾紙或薄膜過濾器。選用不一樣直徑的濾紙，清洗量應(yīng)開展相對應(yīng)的調(diào)節(jié)。挑選濾紙材料時要確保供試品以及有機溶劑不危害微生物菌種的充足被截流。過濾裝置及濾紙應(yīng)用前要選用適合的方式殺菌。應(yīng)用時，應(yīng)確保濾紙在過慮前后左右的一致性。
10.2.3 水溶供標(biāo)準(zhǔn)溶液過慮前先將小量的清洗液過慮以濕潤濾紙。原料油供試品，其濾紙和過濾裝置在應(yīng)用前要充足干躁。為充分發(fā)揮濾紙的較大 過濾效率，應(yīng)留意維持供試品水溶液及清洗液遮蓋全部濾紙表層。供標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)塑料薄膜過慮后，若必須用清洗液清洗濾紙，以濾紙直徑為50毫米的濾紙計，每一張濾紙每一次清洗量不超過100ml，總清洗量不可超出100ml；別的直徑的濾紙及薄膜過濾器可按膜總面積占比調(diào)節(jié)，總的標(biāo)準(zhǔn)是防止大容積、過高水流量的清洗導(dǎo)致濾紙上的微生物菌種受損害。
10.2.4 因為供標(biāo)準(zhǔn)溶液中一些不可以根據(jù)濾紙的顆粒物存有，經(jīng)常導(dǎo)致濾紙阻塞、工作壓力上升，比較嚴(yán)重狀況時很有可能產(chǎn)生過濾系統(tǒng)爆裂導(dǎo)致安全生產(chǎn)事故或試驗室環(huán)境污染；也很有可能產(chǎn)生因為工作壓力過大濾紙裂開或濾膜孔徑增大，導(dǎo)致濾紙對微生物菌種的過慮截流不成功。因此，操作過程中應(yīng)考慮到對塑料薄膜過慮中的工作壓力操縱和機器設(shè)備的安全系數(shù)，設(shè)定一定的安全性工作壓力程度，比如濾紙兩邊壓力差不可過50psi。實際工作壓力程度應(yīng)依據(jù)實際塑料薄膜過濾系統(tǒng)及濾紙明確。
10.2.5 選用適度方式除去供標(biāo)準(zhǔn)溶液中的顆粒物（前提條件是不可以危害微生物菌種的利用率）、適度提升塑料薄膜總面積或減少過慮液態(tài)水流量能夠 合理減少濾紙兩邊的壓差。
10.2.6 取等同于每一張濾紙含1g、1ml或10cm2供試品的供標(biāo)準(zhǔn)溶液，加至適當(dāng)?shù)挠推嵯♂寗┲?，攪拌，過慮。若供試品每1g、1ml或10cm2含有的菌數(shù)較多時，可用適合稀釋液級的供標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，過慮。用pH7.0無菌檢測氧化鈉－蛋白胨緩沖溶液或別的適合的清洗液清洗濾紙，清洗方式和清洗量見10.2.3及10.2.4。清洗后取下濾紙，菌臉朝上貼到營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液或玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液或酵母菌浸取粉胨葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液平板電腦上塑造。每個培養(yǎng)液最少制取一張濾紙。濾紙貼到平板電腦處時不可有間隙或汽泡，不然危害微生物菌種生長發(fā)育。
10.2.7 貼膏藥宜選用塑料薄膜過濾法開展病菌、黃曲霉菌及酵母菌計數(shù)。
10.2.8 陰性對照實驗 取實驗用的封閉液1ml照以上塑料薄膜過濾法實際操作，做為陰性對照。陰性對照不可有菌生長發(fā)育。
10.2.9 塑造和記數(shù) 塑造標(biāo)準(zhǔn)和記數(shù)方式同平皿法，一片濾紙上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。
10.2.10 菌數(shù)報告標(biāo)準(zhǔn) 以等同于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾紙上無菌落生長發(fā)育，以＜1報告菌數(shù)（每一張濾紙過慮1g、1ml或10cm2供試品），或＜1乘以最少稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。
10.3 培養(yǎng)液稀釋液法
取低稀釋液級供標(biāo)準(zhǔn)溶液（源液或1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液或別的供標(biāo)準(zhǔn)溶液）2份，每一份各1ml，各自引入平皿中（每皿0.5ml、0.2ml或＜0.1m1），每一個平皿竭盡營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液約15ml，攪拌，凝結(jié)后，顛倒塑造，記數(shù)。
每一份供標(biāo)準(zhǔn)溶液所充注平板電腦點計的菌落之和，即是每lml菌落數(shù)，共得2組數(shù)據(jù)信息。以2份低稀釋液級供標(biāo)準(zhǔn)溶液菌落數(shù)的均值乘以稀釋倍數(shù)報告。
10.4 結(jié)果報告
10.4.1 菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按登記數(shù)據(jù)信息報告。
10.4.2 菌落數(shù)超過100時，取倆位有效數(shù)字報告，第三位按數(shù)據(jù)修約規(guī)則解決。
10.5 考研復(fù)試
供試品細(xì)菌數(shù)、黃曲霉菌及酵母菌菌數(shù)在其中任一項一次檢測不過關(guān)，需從同一批試品中任意再次取2倍包裝量的供試品，依規(guī)作單項工程考研復(fù)試2次，以三次檢測結(jié)果的平均值報告。若3次結(jié)果的均值超出該種類項下的要求，判供樣品不符合要求；不然，判供樣品符合要求。
10.6 常見問題
10.6.1 菌落記數(shù)測量每計數(shù)單位（每皿或每膜）的適宜記數(shù)范疇不適合過低，一般 每計數(shù)單位不可低于25cfu，小于這一程度越多差值越大，故應(yīng)依據(jù)具體微生物限度規(guī)范和環(huán)境污染水平明確適合的供標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液等比級數(shù)和記數(shù)測定法。當(dāng)規(guī)范程度過低或由于實際操作必須供試品稀釋液水平過高，能夠 取很大容積供標(biāo)準(zhǔn)溶液根據(jù)塑料薄膜過濾法聚集記數(shù)測量。不一樣程度規(guī)范宜選用的供標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液級及相匹配宜選用的記數(shù)測定法見下表3。
表3 不一樣程度規(guī)范宜選用的供標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液級及相匹配宜選用的記數(shù)測定法
| 程度規(guī)范 cfuㄍg，ml，10cm2 |
一般2～3個供標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液級相匹配宜采用的記數(shù)測定法 |
||||
| 源液 |
1:10（－1） |
1:102（－2） |
1:103（－3） |
1:104（－4） |
|
| ＜10 |
■ |
■ |
|
|
|
| 10 |
●■ |
■ |
|
|
|
| 100 |
●▲■ |
●■ |
■ |
|
|
| 1000 |
|
●▲■ |
●■ |
■ |
■ |
| 10000 |
|
●▲ |
●▲■ |
●■ |
●■ |
| 100000 |
|
|
●▲ |
●▲ |
|
●：平皿法（供試液體積：1mlㄍ皿）；
▲：平皿法（培養(yǎng)液稀釋液法供試液體積：＜1mlㄍ皿）；
■：塑料薄膜過濾法（供試液體積能夠 較為靈便）。
10.6.2 供試品檢測整個過程務(wù)必合乎無菌技術(shù)規(guī)定。應(yīng)用殺菌用品時，不可以觸碰很有可能環(huán)境污染的一切器皿，殺菌塑料吸管不可用口吹吸。
10.6.3 供試液從制取至添加檢測用培養(yǎng)液，不可超出1h。不然，很有可能造成微生物菌種繁育或身亡而危害記數(shù)結(jié)果。
10.6.4 供試液稀釋液及注皿時應(yīng)選勻稱的供試液，以防導(dǎo)致試驗差值。
10.6.5 為防止細(xì)菌菌落擴散生長發(fā)育，宜采用以下方式解決：
10.6.5.1 打開表蓋干躁 將已凝結(jié)的瓊脂平板電腦打開表蓋，顛倒斜放在超凈工作臺上，啟動1～1h后盒蓋，放進(jìn)恒溫箱塑造。
10.6.5.2 換陶瓦蓋 將已凝結(jié)的瓊脂平板電腦蓋換掉新近干熱滅菌的陶瓦蓋。
10.6.5.3 加TTC 于竭盡培養(yǎng)液前，在每1000ml營養(yǎng)成分瓊脂內(nèi)添加殺菌1％TTC水溶液1ml（最后濃度值為0.001％），攪拌后竭盡平皿。
11 檢測報告撰寫
本產(chǎn)品按《中國藥典》2010年版微生物限度檢測法規(guī)范檢測，結(jié)果合乎或不符合要求。
表4 病菌、黃曲霉菌、酵母形狀特點較為（營養(yǎng)成分瓊脂及玫紅鈉瓊脂平板電腦）
| 菌體形狀 |
病菌 |
黃曲霉菌 |
酵母 |
|
| 菌 落 |
尺寸 |
區(qū)別非常大，在同一平板電腦上可發(fā)生針頭尺寸至超過10mm菌落 |
一般很大，亦有細(xì)微的菌體。在同一平板電腦上生長發(fā)育的菌體尺寸有時候不一致 |
大部分直徑為1～2毫米，在同一平板電腦上生長發(fā)育的菌體尺寸有時候不一致 |
| 外型形狀 |
多種多樣，小而凸起或大而平扁 |
多見環(huán)形，有的擴散生長發(fā)育為不定形 |
培養(yǎng)液表層生長發(fā)育者多見環(huán)形，里層生長發(fā)育者為環(huán)形、鐵餅、紡錘或三角形 |
|
| 顏色 |
白、灰白色或沒有顏色，亦有淡褐、淺黃及暗紅色，菌體正反兩面色調(diào)同樣 |
小菌體灰白色，大菌落形成胞子后色調(diào)多種多樣。菌體正反兩面色調(diào)不一樣 |
乳白色或淡粉色多見，在同一平板電腦上色彩較單一 |
|
| 清晰度 |
全透明或不全透明 |
小菌體透明色有顯著折光率性，大菌體不全透明 |
全透明較弱 |
|
| 邊沿 |
齊整或不齊整。有放射線狀、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、鋸齒形、卷頭發(fā)狀。低瞄準(zhǔn)鏡下一般見不上邊沿 |
菌絲組成，多呈放射形 |
齊整、高倍下由此可見球形．卵圓環(huán)狀或假真菌狀．體細(xì)胞細(xì)膩排序 |
|
| 味道 |
一般有異味 |
通常有異味 |
多帶酒香氣 |
|
| 與培養(yǎng)液融合 |
不融合 |
融合較堅固，不容易挑動 |
不融合，易挑動 |
|
| 生長發(fā)育速率 |
一般迅速 |
比較慢 |
較快 |
|
| 細(xì) 胞 |
形狀 |
球或桿狀，細(xì)微均一。高倍鏡或油鏡下可觀查形狀 |
菌絲相輔相成．完善黃曲霉菌經(jīng)常出現(xiàn)產(chǎn)孢機構(gòu)及胞子 |
大部分為圓或橢圓狀，經(jīng)常出現(xiàn)芽體相接 |
| 排序 |
單獨、分散化或有一定的排序方法 |
絮狀交錯 |
單獨分散化 |
|
二、操縱菌查驗
l 概述
操縱菌查驗是用以查驗一些特殊微生物菌種（操縱菌或別的病原菌），要求按一次驗出結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，不會再考研復(fù)試。
因為操縱菌查驗為一次性匯報試驗結(jié)果，故應(yīng)留意方式的實效性確診（方式認(rèn)證或陽性對照）、試驗全過程確保和結(jié)果確診，以提升 檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。既要防止漏驗導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。還要防止試驗室環(huán)境污染導(dǎo)致的陽性結(jié)果。
操縱菌查驗中，涉及到試驗室監(jiān)管菌種的分離出來評定、試品呈陽性菌種的分離出來剖析、方式認(rèn)證實驗中的陽性菌實際操作等，應(yīng)在專業(yè)的陽性菌試驗室開展。除另有要求外，陽性菌試驗室應(yīng)符合我國Ⅱ級院內(nèi)感染規(guī)范，陽性菌試驗室應(yīng)配置生物安全柜。陽性菌實際操作不可在供試品檢測用清潔試驗室內(nèi)開展。
2 方式認(rèn)證
在創(chuàng)建供試品的操縱菌檢測法或原檢測法的檢測標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生改變很有可能危害檢測結(jié)果的精確性時，解決供試品的抗菌特異性及檢測法的穩(wěn)定性開展認(rèn)證。認(rèn)證時．按各供試品微生物限度項下的要求（給藥途徑）挑選相對應(yīng)的菌種，并按供試液的制取和操縱菌檢測法所要求的方式開展。
2.1 儀器設(shè)備、機器設(shè)備及用品
見各操縱菌查驗項下。
2.2 試液、標(biāo)示液
見各操縱菌查驗項下。
2.3 培養(yǎng)液
見各操縱菌查驗項下。
2.4 方式認(rèn)證用規(guī)范菌種
應(yīng)依據(jù)實際種類項下的總體目標(biāo)操縱菌挑選相對應(yīng)的認(rèn)證用規(guī)范菌種，常見總體目標(biāo)操縱菌的規(guī)范菌種以下：
大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102]
橙黃色鏈球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B) 26003]
乙型肝炎副傷寒沙門菌Salmonella paratyphi B[CMCC(B) 50094]
銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC(B) 10104]
生孢梭菌Clostridium sporogenes[CMCC(B)64941]
白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001]
菌液制取取大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、乙型肝炎副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌塑造物少量，打疫苗至l0ml營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液內(nèi)，置30～35℃塑造18～24小時，取勻稱塑造物1ml，用0.9％無菌檢測氯化鈉溶液稀釋液成每1ml含菌10～100cfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對比實驗的另外用營養(yǎng)成分瓊脂注皿或平板電腦施膠，經(jīng)塑造后記數(shù)明確。生孢梭菌打疫苗至12ml硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)液中，置30～35℃塑造18～24小時，用0.9％無菌檢測氯化鈉溶液做成1ml含10～100cfu的菌液。
2.5 供試液的制?。ㄒ姴【ⅫS曲霉菌及酵母菌計數(shù)）
2.6 認(rèn)證方式
2.6.1 實驗組取規(guī)定量供試液和10～100cfu實驗菌添加增菌培養(yǎng)液中，按相對應(yīng)操縱菌的檢測法開展查驗。當(dāng)選用塑料薄膜過濾法時，實驗菌需加在最后一次清洗液中，清洗后，取下濾紙引至增菌培養(yǎng)液中。
2.6.2 陽性對照 取10～100cfu實驗菌添加增菌培養(yǎng)液中，按相對應(yīng)操縱菌的檢測法開展查驗。
2.6.3 陰性對照取相對應(yīng)的封閉液取代供試液，按相對應(yīng)操縱菌的檢測法開展查驗。
2.7 結(jié)果判斷
呈陽性對照實驗應(yīng)驗出實驗菌，陰性對照組應(yīng)無菌檢測生長發(fā)育。若實驗組驗出實驗菌，按此供試液制取法和操縱菌檢測法開展供試品的該操縱菌查驗；若實驗組未驗出實驗菌，應(yīng)創(chuàng)建新的方式，清除供試品的抗菌特異性，并再次認(rèn)證。
認(rèn)證實驗可與供試品的操縱菌檢查另外開展。
（一）大腸埃希菌
1 概述
大腸埃希菌（Escherichia coli）即大腸埃希菌，為腸桿菌科埃希菌屬的方式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)覺有非脫羧反應(yīng)埃希菌等五個種。大腸埃希菌是人與溫血動物腸胃內(nèi)的棲息菌，隨排泄物排出來身體之外。在藥物中驗出大腸埃希菌。說明該試品遭受人與溫血動物的排泄物環(huán)境污染，即很有可能環(huán)境污染腸胃病原菌。大腸埃希菌除一般大腸埃希菌外還有高致病大腸埃希菌，可造成嬰兒、成年人爆發(fā)式拉肚子。為保汪身體健康，口服藥品務(wù)必查驗大腸埃希菌。
用4-羥基傘狀酮葡糖苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG）和靛栽培基質(zhì)（indole）實驗查驗大腸埃希菌是一項新技術(shù)應(yīng)用，其檢測流程為：增菌塑造后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)液塑造，大部分狀況下不用從混和菌中分離出來單獨菌，如MUG、Indole實驗為呈陽性或呈陰性就可以匯報結(jié)果。
基本原理：運用總體目標(biāo)菌限制酶功效的底物的水解反應(yīng)物質(zhì)，造成色調(diào)或熒光反應(yīng)做為標(biāo)示系統(tǒng)軟件來評定總體目標(biāo)菌。
試驗證實96％的大腸埃希菌含β-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUD)，約10％的沙門氏菌屬一些菌苗也帶有此酶。MUG被GUD水解反應(yīng)，造成瑩光，因為熒光反應(yīng)的敏感性較顏色反應(yīng)強千萬倍，便于觀查，沒有主觀，因此用MUG評定大腸埃希菌已被廣泛運用于臨床醫(yī)學(xué)、食品類、飲用水、廢水等的檢驗。單一的MUG辨別大腸埃希菌其漏驗率達(dá)6％，由于98％的大腸埃希菌基靛栽培基質(zhì)實驗為呈陽性，故將MUG與靛栽培基質(zhì)實驗融合，比只用MUG可提升 大腸埃希菌的診斷率。如MUG與Indole實驗的反映不一致時，則需將供標(biāo)準(zhǔn)溶液的增菌塑造物用EMB瓊脂平板電腦分離出來塑造、革蘭氏染色、鏡檢查及生物化學(xué)實驗辨別。該法理論上可使大腸埃希菌的診斷率達(dá)98％。
如僅用IMViC生物化學(xué)實驗來辨別大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌，專屬性不強。
2 儀器設(shè)備、機器設(shè)備及用品（參考病菌、黃曲霉菌及酵母菌計數(shù)）
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)示液
3.1 0.9％無菌檢測氯化鈉溶液（配件二3.1）
3.2 無菌檢測聚磷酸鹽緩沖液（pH7.2）（配件二3.3)
3.3 無菌檢測對羥基苯甲酸水溶液（配件二2.2）
3.4 無菌檢測聚山梨酯80氯化鈉溶液（配件二3.2）
3.5 靛栽培基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.17）
3.6 甲基紅標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二4.2）
3.7 V-P標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.11，2.13）
3.8 革蘭氏染色液（配件二2.4，2.10，2.16）
3.9 中性化紅標(biāo)示液（配件二4.1）
3.10 亞甲藍(lán)標(biāo)示液（配件二4.3）
3.11 溴麝香草酚藍(lán)標(biāo)示液（配件二4.6）
3.12 酸堿性品紅標(biāo)示液（配件二4.7）
3.13 曙紅鈉標(biāo)示液（配件二4.9）
4 培養(yǎng)液
4.1 營養(yǎng)成分骨頭湯（配件二5.1）
4.2 營養(yǎng)成分瓊脂（配件二5.2）
4.3 膽鹽乳清蛋白（BL）培養(yǎng)液（配件二5.6）
4.4 4－羥基傘狀酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)液（配件二5.7）
4.5 乳清蛋白發(fā)醇培養(yǎng)液、乳清蛋白膽鹽發(fā)醇培養(yǎng)液、5％乳清蛋白培養(yǎng)液（配件二5.21，5.22）
4.6 蛋白胨水培養(yǎng)液（配件二5.18）
4.7 聚磷酸鹽葡萄糖水胨水培養(yǎng)液（配件二5.19）
4.8 枸櫞酸鹽培養(yǎng)液（配件二5.20）
4.9 曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂（配件二5.8）
4.10 麥康凱瓊脂（配件二5.9）
5 提前準(zhǔn)備
5.1 對比用菌液（見方式認(rèn)證）
5.2 供試品的檢測量（見病菌、黃曲霉菌及酵母菌計數(shù)5.3）
5.3 供標(biāo)準(zhǔn)溶液的制取（見病菌、黃曲霉菌及酵母菌計數(shù)）
6 操作流程
6.1 檢測程序流程
陽性對照實驗 供試品開展操縱菌查驗時，應(yīng)做陽性對照實驗。陽性對照實驗的加菌量為10～100cfu，供試品和增菌培養(yǎng)液使用量及查驗按供試品的操縱菌查驗。陽性對照實驗應(yīng)驗出相對應(yīng)的操縱菌。
陰性對照實驗 取油漆稀釋劑十米1加入100ml（或200 m1）相對應(yīng)操縱菌查驗用的增菌培養(yǎng)液中，塑造，應(yīng)無菌檢測生長發(fā)育。
6.2 增菌塑造 取膽鹽乳清蛋白（BL）培養(yǎng)液3瓶，一瓶各100ml。2瓶各自添加規(guī)定量的供標(biāo)準(zhǔn)溶液（等同于供試品1g、lml、10cm2），在其中1瓶添加對比菌10～一百個作陽性對照，第三瓶添加與供標(biāo)準(zhǔn)溶液相等的油漆稀釋劑作陰性對照。塑造18～24小時，必需時可延到48h。陰性對照應(yīng)無菌檢測生長發(fā)育。
取以上塑造物0.2ml，打疫苗至含5ml MUG培養(yǎng)液的試管嬰兒內(nèi)，塑造，于5、24小時在366nm紫外線下觀查，另外用未打疫苗的MUG培養(yǎng)液作本底對比。在紫外線下若管中塑造物展現(xiàn)淺藍(lán)色瑩光，為MUG呈陽性；不展現(xiàn)瑩光，為MUG呈陰性。觀查后，沿塑造管的壁厚添加數(shù)滴靛栽培基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，液位呈玫瑰紅色，為靛栽培基質(zhì)呈陽性；呈實驗試劑原色，為靛栽培基質(zhì)呈陰性。本底對比的MUG和靛栽培基質(zhì)實驗應(yīng)是呈陰性。如MUG呈陽性、靛栽培基質(zhì)呈陽性，判供試IQC出大腸埃希菌；如MUG呈陰性、靛栽培基質(zhì)呈陰性，判供樣品未驗出大腸埃希菌。
6.3 分離出來塑造如展現(xiàn)MUG呈陽性、靛栽培基質(zhì)呈陰性或MUG呈陰性、靛栽培基質(zhì)呈陽性時，應(yīng)將以上供試品BL增菌細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕地?fù)u晃，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)液畫線于EMB或麥康凱瓊脂平板電腦上。塑造18～24小時。若平板電腦上無菌檢測落生長發(fā)育、或生長發(fā)育的菌體與表1列出的菌體形狀特點不符合，判供樣品未驗出大腸埃希菌。
表1 大腸埃希菌菌體形狀特點
| 培養(yǎng)液 |
菌體形狀 |
| 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 |
呈紫黑、淡紫色、紫藍(lán)色或淡粉色，菌體管理中心呈淺紫色或無顯著深色管理中心，環(huán)形，稍突起，邊沿齊整，表層光潔，潮濕，經(jīng)常出現(xiàn)金屬質(zhì)感 |
| 麥康凱瓊脂 |
鮮玫紅色或微鮮紅色，菌體管理中心呈深玫紅色，環(huán)形，平扁，邊沿齊整，表層光潔，潮濕 |
當(dāng)陽性對照的平板電腦呈典型性菌體生長發(fā)育時，若EMB或麥康凱瓊脂平板電腦上生長發(fā)育的菌體與表1列出菌體形狀特點相符合或疑是者，應(yīng)挑取異常菌體開展分離出來、提純、上色鏡檢查和IMViC實驗，確定是不是為大腸埃希菌。
為了更好地標(biāo)準(zhǔn)實際操作，下列是對中國藥典規(guī)定的填補。
6.4 純塑造 如EMB或麥康凱瓊脂平板電腦上生長發(fā)育的菌體與表1列出特點相符合或疑是者，以接種針輕輕地觸碰單獨疑是菌體的表層管理中心，沾取塑造物，應(yīng)選擇2～3個之上疑是菌體，各自打疫苗營養(yǎng)成分瓊脂斜坡，塑造18～24小時，作下列查驗。
如平板電腦上無單獨異常菌體，但有異常菌團（紫黑，或有金屬質(zhì)感），應(yīng)沾取異常菌團塑造物少量，或再次取增菌細(xì)胞培養(yǎng)液畫線打疫苗于EMB瓊脂平板電腦，塑造18～24小時，再選擇單獨疑是菌體，純塑造，作下列查驗。
6.5 革蘭氏染色、鏡檢查
6.5.1 以接種環(huán)沾取無菌水于清潔蓋玻片上，取以上疑是菌體的營養(yǎng)成分瓊脂斜坡新鮮塑造物少量，做成勻稱玻片，當(dāng)然或微溫，再根據(jù)火苗2～3次干躁使固定不動。
6.5.2 滴入結(jié)晶紫染色液，上色1min，水清洗。
6.5.3 滴入碘液，媒染1min，水清洗，以過濾紙吸走余水。
6.5.4 滴入95%酒精，褪色20～30s，至排出液沒有顏色，水清洗。
6.5.5 滴加沙黃染色液，復(fù)染1min，待干后，鏡檢查。
6.5.6 上色結(jié)果
革蘭陽性菌呈紫藍(lán)色；革蘭陰性菌呈鮮紅色。
大腸埃希菌為革蘭呈陰性短鏈球菌，或球桿菌狀，亦有鏈球菌狀。
6.5.7 常見問題
6.5.7.1 裝片務(wù)必清潔，無刮痕。玻片的菌量宜少，菌液不能太濃。不然，菌體細(xì)胞大堆或連一片。上色反映難以分辨，不好菌體細(xì)胞的形狀觀查。
如菌液太濃，須再取清潔蓋玻片進(jìn)一步稀釋液。
6.5.7.2 塑造物的菌齡以16～24小時為宜。塑造時間太長的革蘭陽性菌易染上鮮紅色。
6.5.7.3 褪色是重要。褪色時間不夠，菌體細(xì)胞易染上呈陽性；褪色時間太長，菌體細(xì)胞易染上呈陰性。
7 生物化學(xué)實驗
7.1 乳清蛋白發(fā)醇實驗 取以上斜坡塑造物，打疫苗于乳清蛋白發(fā)醇管，塑造24～48h，觀查產(chǎn)酸（顯色劑為酸堿性品紅者為鮮紅色；顯色劑為溴麝香草酚藍(lán)者為淡黃色），脹氣（小倒管中有汽泡，汽泡不管尺寸全是脹氣）。
為防止緩慢發(fā)醇乳清蛋白造成假陰性，也可以打疫苗5％乳清蛋白發(fā)醇管。絕大部分緩慢發(fā)醇乳清蛋白的病菌，可于24小時發(fā)生呈陽性?；蜻m度增加塑造時間。
7.2 靛栽培基質(zhì)實驗（Ⅰ） 取以上斜坡塑造物，打疫苗于蛋白胨水培養(yǎng)液，塑造24～48h，沿壁厚添加靛栽培基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液數(shù)滴，輕輕地?fù)u晃試管嬰兒，液位呈玫瑰紅色為呈陽性，呈實驗試劑原色為呈陰性。98％的大腸埃希菌靛栽培基質(zhì)實驗為呈陽性。一般24小時就可以發(fā)生呈陽性結(jié)果，以無菌操作原則先從管內(nèi)取下1或2ml細(xì)胞培養(yǎng)液開展查驗，如靛栽培基質(zhì)是呈陰性，剩下的蛋白胨水塑造物再塑造24小時，作靛栽培基質(zhì)實驗。
7.3 甲基紅實驗（M） 取以上斜坡塑造物，打疫苗于聚磷酸鹽葡萄糖水胨水培養(yǎng)液中，塑造48±1h，于細(xì)胞培養(yǎng)液中添加甲基紅標(biāo)示液2～3滴（約每ml細(xì)胞培養(yǎng)液加標(biāo)示液1滴），輕度搖晃，馬上觀查，呈紅色或桔紅色為呈陽性，呈淡黃色為呈陰性。
7.4 乙酰羥基乙醇轉(zhuǎn)化成實驗（V-P） 取以上斜坡塑造物。打疫苗于聚磷酸鹽葡萄糖水胨水培養(yǎng)液中，塑造48±1h，于2ml細(xì)胞培養(yǎng)液中添加α-萘酚酒精標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，攪拌，再加40％三氯化鐵溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2ml，充足振搖，在4h（一般 在30min）內(nèi)發(fā)生鮮紅色應(yīng)判為呈陽性，無鮮紅色反映為呈陰性。
7.5 枸櫞酸鹽運用實驗（C） 取以上斜坡塑造物，打疫苗于枸櫞酸鹽培養(yǎng)液斜坡上，塑造2～四天，培養(yǎng)液斜坡有菌苔生長發(fā)育，培養(yǎng)液由翠綠色變成深藍(lán)色時為呈陽性，培養(yǎng)液色調(diào)無更改、無菌檢測生長發(fā)育為呈陰性。
8 結(jié)果分辨
8.1 當(dāng)陰性對照試驗呈陰性，陽性對比實驗MUG呈陽性，供試品MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，匯報1g或1ml供試IQC出大腸埃希菌。MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，匯報1g或1ml供試品未驗出大腸埃希菌。
8.2 MUG陽性、靛基質(zhì)陰性、IMViC實驗為－＋??、革蘭陰性鏈球菌，匯報1g或1ml供試IQC出大腸埃希菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陽性、IMViC實驗為＋＋??、革蘭陰性鏈球菌，匯報1g或1ml供試IQC出大腸埃希菌。
8.3 供試品塑造物查驗不符8.2二項中的任一項，匯報1g或1ml供試品未驗出大腸埃希菌。
8.4 當(dāng)陰性對比有菌生長發(fā)育或陽性對比未生長發(fā)育或生長發(fā)育菌體并不是大腸埃希菌，不可以作出檢測報告。
9 常見問題
9.1 MUG法無須從混和菌中分離出來單獨菌體。除大腸埃希菌外，還有一部分志賀菌屬、沙門氏菌屬的菌種；及其極少數(shù)革蘭陽性革蘭陰性桿菌、鏈球菌和芽胞菌，其MUG為陽性。因而，在MUG培養(yǎng)液成份中提升了去氧膽酸鈉的量，可清除革蘭陽性菌的影響。在膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液中志賀菌、沙門氏菌較難生長發(fā)育。
9.2 配置MUG培養(yǎng)液時，盡量校準(zhǔn)pH值，殺菌后pH不可過7.4，不然pH值較高，MUG溶解，自身則顯瑩光；散裝MUG培養(yǎng)液的試管嬰兒應(yīng)選擇，試管嬰兒、蛋白胨不可顯瑩光。
9.3 塑造時間 供試品細(xì)胞培養(yǎng)液打疫苗于MUG培養(yǎng)液中，一般塑造5h和24小時要觀查是不是造成瑩光，如瑩光很很弱，不可以精確分辨時，能延長塑造至48h再觀查結(jié)果。因為大腸埃希菌各菌種間的GUD的特異性不完全一致，對底物和底物的濃度值反映的差別；培養(yǎng)液中挑選因素的危害；塑造時問、溫度；pH值的更改；很多市場競爭菌和試品自身化學(xué)物質(zhì)成份的影響等，對結(jié)果的分辨亦有影響。
9.4 結(jié)果觀查 取供試品的MUG實驗管、陽性對照料、陰性對照料另外在366nm紫外線燈下觀查，陽性對照料應(yīng)該有極強的淺藍(lán)色瑩光，陰性對照料無瑩光。供試品MUG管是不是有瑩光，應(yīng)認(rèn)真觀察較為，或?qū)⒏鞴芴鎿Q部位（陰性管垂直居中），適度歪斜試管嬰兒。如陽性對照料瑩光明顯，危害供試品質(zhì)工程師與陰性對照料的觀查時，也可以移去陽性對照料。
9.5 藥物中環(huán)境污染的大腸埃希菌，易受生產(chǎn)工藝流程及藥品的危害。在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂平板電腦上的菌體形狀特點時有轉(zhuǎn)變 ，挑取異常菌體通常憑工作經(jīng)驗，主觀很大，盡量選擇2～3個之上菌體各自做IMViC實驗辨別，選擇菌體越多，驗出陽性菌的概率越高，如僅選擇一個菌體做IMViC實驗辨別．則易漏驗。
9.6 在IMViC實驗中，以殺菌接種針沾取菌苔，最先打疫苗于枸櫞酸鹽瓊脂斜坡上，隨后打疫苗于蛋白胨水培養(yǎng)液、聚磷酸鹽葡萄糖水胨水培養(yǎng)液中。切忌將培養(yǎng)液帶到枸櫞酸鹽瓊脂斜坡上，以防造成假陽性結(jié)果。
依據(jù)實驗材料，發(fā)覺一些菌塑造三天后，構(gòu)櫞磷酸鹽運用實驗造成陽性，故僅塑造2天是不足的，枸櫞酸鹽運用實驗塑造時間能延長至四天。
9.7 以IMViC實驗來分辨大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌是含糊的。IMViC實驗為＋＋??者，除大腸埃希菌外，也有非活躍性大腸埃希菌（E.coli jnactive）、弗格森埃希菌（E.fergusonii）、赫爾姆埃希菌（E.hermanii）。IMViC實驗為－＋??者，除大腸埃希菌外，也有非活躍性大腸埃希菌（E.coli inactive）、創(chuàng)口埃希菌（E.vulneris）、臭蟲埃希菌（E.blattae）。
9.8 陽性對比實驗是查驗供試品是不是有殺菌作用及塑造標(biāo)準(zhǔn)是不是適合。陽性對比菌液的制取、記數(shù)及添加含供試品的培養(yǎng)液中等水平實際操作，不可以在檢驗供試品的清潔試驗室或凈化處理臺子上開展，務(wù)必在獨立的防護間或凈化臺實際操作，以防環(huán)境污染供試品及實際操作自然環(huán)境。
9.9 在各種供試品中檢驗大腸埃希菌以及他操縱菌，按一次驗出結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，不會再取樣復(fù)檢。驗出的大腸埃希菌以及他操縱菌塑造物須保存一個月，備查簿。
（二）大腸桿菌
1 概述
大腸桿菌（Coliform）就是指37℃生長發(fā)育時要發(fā)醇乳清蛋白，在24小時內(nèi)產(chǎn)酸脹氣的革蘭陰性無枯草芽孢菌。合乎以上界定的病菌除大腸埃希菌屬（Escherichia）的大部分菌外，還包含腸桿菌科的腸桿菌屬（Enterobacter）、枸櫞酸菌屬（Citrobacter）、克雷伯菌屬（Klebsiella）的大部分菌。大腸桿菌包含了平常人畜腸胃外需氧的的大部分革蘭陰性鏈球菌。以大腸桿菌做為環(huán)境衛(wèi)生指示菌比操縱大腸埃希菌具備普遍的微生物學(xué)實際意義，查驗方式簡單。因而，國際性內(nèi)以大腸桿菌做為藥物、食品類、飲用水等的環(huán)境衛(wèi)生指示菌，對環(huán)境衛(wèi)生品質(zhì)的規(guī)定更嚴(yán)苛。
大腸桿菌的查驗根據(jù)增菌、分離出來、革蘭氏染色、鏡檢查和確診實驗等流程。
2 儀器設(shè)備、機器設(shè)備及用品（見大腸埃希菌檢測法）
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)示液（見腸子埃希茵檢測法）
4 培養(yǎng)液
4.1 乳清蛋白發(fā)醇培養(yǎng)液（配件二5.21）
4.2 乳清蛋白膽鹽發(fā)醇培養(yǎng)液（配件二5.22）
4.3 曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂（附則5.8）
4.4 麥康凱瓊脂（附則5.9）
5 對比用菌液（大腸埃希菌，同操縱菌方式認(rèn)證2.4）
6 操作流程
6.1 操作流程
6.2 增菌塑造 取乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管3支，各自添加1:10稀釋液的供試液1ml（含供試品0.1g或0.1米1)、1:100稀釋液的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）和1:1000稀釋液的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）。另取1支乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管，添加油漆稀釋劑1ml做為陰性對比。均塑造18～24小時，觀查結(jié)果。
加供試液的乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管若無菌檢測生長發(fā)育、或有菌生長發(fā)育但不產(chǎn)酸脹氣，則判該管未驗出大腸桿菌。若乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)進(jìn)一步分離出來塑造。
6.3 分離出來塑造 將以上產(chǎn)酸脹氣的發(fā)醇管內(nèi)的塑造物，各自畫線打疫苗于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)液或麥康凱瓊脂培養(yǎng)液的平板電腦上，塑造18～24小時。
大腸桿菌的菌體在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)液平板電腦上呈紫黑或暗紫色，環(huán)形，稍突起，邊沿齊整，表層光潔，潮濕；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)液的平板電腦上呈鮮玫紅色或淡粉色，環(huán)形，平扁，邊沿齊整，表層光潔，潮濕。若平板電腦上無菌檢測落生長發(fā)育，或生長發(fā)育的菌體與以上菌體特點不符合或者是為非革蘭陰性無枯草芽孢菌，判該管未驗出大腸桿菌；若平板電腦上生長發(fā)育有疑是菌體，并且是革蘭陰性無枯草芽孢菌，應(yīng)開展確診實驗。
6.4 確診實驗 從以上分離出來平板電腦上選擇4～五個疑是菌體，各自打疫苗于乳清蛋白發(fā)醇管內(nèi)，塑造24～兩天。若產(chǎn)酸脹氣，判該乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管驗出大腸桿菌，不然判未驗出大腸桿菌。
6.5 結(jié)果分辨 依據(jù)大腸桿菌的驗出管數(shù)，按表2匯報1g或1ml供試品中的大腸桿菌數(shù)。
表2 大腸桿菌MPN（Most probable number）表
| 各供試品量的驗出結(jié)果 |
最很有可能的大腸桿菌數(shù)N （個ㄍg或ml） |
||
| 1.0g或1.0Ml |
0.1g或0.1ml |
0.01g或0.01ml |
|
| ＋ |
＋ |
＋ |
＞102 |
| ＋ |
＋ |
－ |
10＜N＜102 |
| ＋ |
－ |
－ |
1＜N＜10 |
| － |
－ |
－ |
＜1 |
注：＋ 驗出大腸桿菌。－ 未驗出沙門氏菌
7 常見問題
7.1 加供試液的乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管，因為有的殘渣色調(diào)較深或沉淀較多，影響結(jié)果的觀查。應(yīng)認(rèn)真觀察倒管底端或試管嬰兒壁、細(xì)胞培養(yǎng)液表層有沒有氣泡。針頭大的汽泡也是脹氣。
7.2 乳清蛋白膽鹽發(fā)醇培養(yǎng)液內(nèi)的倒管不小于30mm×3毫米（內(nèi)徑）。不然，倒管被殘渣擋住，麻煩觀查結(jié)果。
7.3 加供試液的乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管，經(jīng)塑造后，其倒管中不管脹氣是多少，均應(yīng)做分離出來塑造，革蘭氏染色、鏡檢查。如脹氣太少，能延長塑造時間。
7.5 盡量多選擇曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)液或麥康凱瓊脂培養(yǎng)液平板電腦上大腸桿菌的異常菌體，做乳清蛋白發(fā)醇確診實驗。挑異常菌體越多，可提升 大腸桿菌診斷率。
（三）沙門氏菌
1 概述
沙門氏菌屬是腸桿菌科的關(guān)鍵病原菌，按《Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第一卷（1984），沙門氏菌分五個亞屬，2003年出版發(fā)行的第八版的《臨床微生物手冊》將沙門氏菌屬分為2個菌苗及結(jié)腸炎沙門氏菌和乍得沙門氏菌，在其中的結(jié)腸炎沙門氏菌分6個亞屬，包含普遍的傷寒論、甲形副傷寒、乙型肝炎副傷寒、丙型副傷寒、鼠傷寒論，豬霍亂等沙門氏菌以內(nèi)，那時候已發(fā)覺2501個血清型。O抗原體抗血清的A-E群包括了沙門氏菌分離出來株的95％，因此用沙門氏菌A-FO鞭毛抗原血清蛋白開展沙門氏菌初篩實驗。藥物中的沙門氏菌，是以評定沙門氏菌屬為標(biāo)準(zhǔn)，即對每20g（或十米1）藥物中是不是驗出沙門氏菌做出檢測報告。
因為沙門氏菌血清型多種多樣，各血清型的生物化學(xué)及血清學(xué)特點雖息息相關(guān)，卻各有不同，選用一種增菌培養(yǎng)液和二種分離出來培養(yǎng)液，不太可能包含全部沙門氏菌的適宜增菌及分離出來標(biāo)準(zhǔn)。除此之外，因為藥物在生產(chǎn)過程中，常遭受加溫、干躁等生產(chǎn)加工流程的危害，藥物中環(huán)境污染的沙門氏菌可遭受損害或呈休眠模式，故須在增菌塑造前先開展預(yù)增菌，隨后再開展增菌及分離出來、三糖鐵瓊脂基本辨別、生物化學(xué)實驗、血清學(xué)實驗等流程。
2 儀器設(shè)備、機器設(shè)備及用品（見大腸埃希菌檢測法2）
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)示液（參照大腸埃希菌檢測法3）
3.1 無菌檢測脲標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.5）
3.2 酚磺酞標(biāo)示液（配件二4.4）
3.3 亮綠標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.9）
3.4 氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.14）
3.5 溴甲酚紫標(biāo)示液（配件二4.5）
3.6 革蘭氏染色液（配件二2.4，2.10，2.16）
3.7 沙門氏菌屬A～F“0”鞭毛抗原血清蛋白（0鞭毛抗原1）。
4 培養(yǎng)液
4.1 營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.2）
4.2 營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液（配件二5.1）
4.3 半固態(tài)營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.3）
4.4 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)液（EMB）（配件二5.8）
4.5 麥康凱瓊脂培養(yǎng)液（MacC）（配件二5.9）
4.6 四硫磺粉酸鈉緩釋片亮綠培養(yǎng)液（TTB）（配件二5.11）
4.7 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)液（TSI）（配件二5.10）
4.8 膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)液（DHL）（配件二5.13）
4.9 沙門氏菌扁志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)液（S.S）（配件二5.12）
4.10 蛋白胨水培養(yǎng)液（配件二5.18）
4.11 脲（尿素溶液）瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.23）
4.12 氰化鉀培養(yǎng)液（配件二5.24）
4.13 磷酸氫鈣脫羧酶培養(yǎng)液（配件二5.25）
5 對比用菌液
取乙型肝炎副傷寒沙門菌[CMCC(B) 50094]的塑造物少量，打疫苗至10ml營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液內(nèi)。30～35℃塑造18～24小時后，用0.9％無菌檢測氯化鈉溶液按10倍增長稀釋液濃度值等同于10～100cfuㄍml，作陽性對照用菌液。其菌液濃度值可以用平板電腦菌落計數(shù)法測出。
6 操作步驟
6.1 準(zhǔn)備工作：[見病菌、黃曲霉菌（酵母）記數(shù)6 ]
6.2 增菌塑造
6.2.1 預(yù)增菌取營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液3份，每一份200ml，1份添加20g或是10ml供試品，攪拌；1份添加供試品及陽性對照菌10～100cfu，攪拌；1份添加油漆稀釋劑10ml作陰性對照，30～35℃塑造18～24小時后觀查。搖晃陰性對照瓶后應(yīng)清澈全透明，無菌檢測生長發(fā)育。
6.2.2 增菌塑造 輕度搖晃供試品增菌塑造瓶及陽性對照瓶，各自汲取1ml打疫苗于1管含10ml四硫磺粉酸鈉緩釋片亮綠培養(yǎng)液的試管嬰兒中，塑造18～24小時。
6.3 分離出來塑造輕度搖晃供試品增菌塑造瓶及陽性對照瓶，各自以接種環(huán)沾取1～2環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)液打疫苗于膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門氏菌志賀菌瓊脂（SS）平板電腦及曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂或麥康凱瓊脂平板電腦各一個，顛倒塑造24～48h，必需時增加至40～48h。查驗平板電腦上面有毫無疑問似沙門氏菌菌體。沙門氏菌在以上平板電腦上的菌體形狀特點見下表。
表3 沙門氏菌的菌體特點
| 平板電腦 |
菌體形狀 |
| 膽鹽硫乳瓊脂（DHL） |
沒有顏色至淺橙色．透明色，菌體管理中心帶灰黑色或所有灰黑色或無灰黑色 |
| 沙門氏菌屬志賀菌屬瓊脂（S.S） |
沒有顏色至暗紅色，透明色或不全透明，菌體管理中心有時候帶深褐色 |
| 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB） |
沒有顏色至淺橙色，全透明或透明色，光潔潮濕的環(huán)形菌體 |
| 麥康凱瓊脂（MacC） |
沒有顏色至淺橙色，全透明或透明色，菌體管理中心有時候為深色 |
因為沙門氏菌不發(fā)醇乳清蛋白和綿白糖，不產(chǎn)酸，菌體不上色，一般為沒有顏色透明色，大部分沙門氏菌因造成H2S，菌體管理中心展現(xiàn)灰黑色乃至全黑色，在DHL瓊脂平板電腦上比較顯著。在SS瓊脂平板電腦上，H2S特點有時候不顯著，沙門氏菌屬亞屬III因大部分菌種發(fā)醇乳清蛋白，故在以上平板電腦上的乳清蛋白發(fā)醇菌體展現(xiàn)粉色或藍(lán)紫色，但因為造成H2S，在有H2S標(biāo)示系統(tǒng)軟件的平板電腦上仍發(fā)生灰黑色管理中心。在以上培養(yǎng)液上，有一些非沙門氏菌屬病菌，也可展現(xiàn)相近沙門氏菌菌體形狀，須進(jìn)一步辨別。因為藥品的危害或非典型菌種的存有，沙門氏菌菌體可展現(xiàn)非典型形狀，如顏色變深，菌體不光滑等，應(yīng)留意鑒別。
6.4 基本辨別實驗
從每一個供試品的分離出來平板電腦上挑取2～3個疑是菌體（菌體形狀特點與表3列出的形狀特點相符合或疑是）各自打疫苗于三糖鐵瓊脂斜坡，打疫苗時要以接種針輕輕地觸碰單獨菌體管理中心位置，沾取塑造物畫線于三糖鐵瓊脂斜坡（或是克氏雙糖鐵瓊脂斜坡）并穿刺術(shù)到最底層或先穿刺術(shù)最底層再畫線斜坡，塑造18～24小時，觀查結(jié)果。
疑是沙門氏菌在三糖鐵瓊脂斜坡上的反映為：①斜坡鮮紅色（產(chǎn)堿），最底層灰黑色（產(chǎn)H2S）并表明淡黃色（產(chǎn)酸）；②斜坡鮮紅色，最底層淡黃色；③斜坡淡黃色，最底層灰黑色，并表明淡黃色。大部分沙門氏菌在三糖鐵瓊脂上造成汽體，使最底層瓊脂發(fā)生汽泡或使瓊脂破裂，但也是有不造成汽體的菌苗。對在三糖鐵瓊脂斜坡淡黃色并另外最底層無灰黑色，斜坡末見鮮紅色最底層末見淡黃色，或斜坡及最底層均為鮮紅色者能夠 清除沙門氏菌。
將疑是沙門氏菌的三糖鐵瓊脂或營養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物作生物化學(xué)實驗，血清蛋白凝結(jié)實驗及革蘭氏染色，鏡檢查。沙門氏菌應(yīng)是革蘭呈陰性鏈球菌。
6.5 生物化學(xué)實驗
6.5.1 靛栽培基質(zhì)實驗 用接種環(huán)沾取少量塑造物，打疫苗到蛋白胨水培養(yǎng)液中，照大腸埃希菌檢測法靛栽培基質(zhì)實驗項下實際操作、分辨結(jié)果。沙門氏菌應(yīng)是陰性反應(yīng)。
6.5.2 脲酶實驗 用接種環(huán)沾取少量塑造物，畫線打疫苗于脲瓊脂斜坡，塑造24小時，觀查結(jié)果。斜坡變成鮮紅色為陽性反應(yīng)，沙門氏菌屬為陰性反應(yīng)。
6.5.3 氰化鉀實驗 將塑造物先打疫苗至營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液中塑造20～24小時，用接種環(huán)沾取細(xì)胞培養(yǎng)液1環(huán)，打疫苗至氰化鉀培養(yǎng)液內(nèi)，另取一環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)液打疫苗于沒有氰化鉀的一樣培養(yǎng)液內(nèi)對著干照料，打疫苗后就是以橡膠塞塞緊，塑造24～48h，觀查結(jié)果。對比管中有菌生長發(fā)育（渾濁），而實驗管也是有菌生長發(fā)育為陽性反應(yīng)；對照料有菌生長發(fā)育（渾濁）而實驗管無菌檢測生長發(fā)育（清澈）為陰性反應(yīng)。沙門氏菌應(yīng)是陰性反應(yīng)。
本實驗應(yīng)十分注意密封性支管，夏季散裝培養(yǎng)液宜在冰浴中開展，避免 氰化鉀溶解，造成氫氰酸逸出，導(dǎo)致培養(yǎng)液內(nèi)氰化鉀濃度值減少，不能抑制病菌生長發(fā)育，導(dǎo)致陽性。
氰化鉀為劇毒品、實際操作時需慎重，切忌用口吸液管。用后的培養(yǎng)液每管加數(shù)粒硫酸鋁和20％三氯化鐵溶液0.5ml去毒。隨后再殺菌、清洗。
6.5.4 磷酸氫鈣脫羧酶實驗用接種環(huán)沾取少量塑造物，打疫苗在磷酸氫鈣脫羧酶培養(yǎng)液中，另外打疫苗一支沒有磷酸氫鈣的一樣培養(yǎng)液做為對照料，塑造24～48h觀查結(jié)果。對照料淡黃色（產(chǎn)酸），實驗管呈藍(lán)紫色為陽性反應(yīng)（磷酸氫鈣脫羧反應(yīng)產(chǎn)堿）；實驗管淡黃色為陰性反應(yīng)。沙門氏菌應(yīng)是陽性反應(yīng)。
6.5.5 驅(qū)動力實驗用接種針沾取塑造物，穿刺接種于半固態(tài)營養(yǎng)成分瓊脂管內(nèi)，塑造24小時，觀查結(jié)果。有驅(qū)動力的病菌能在穿刺術(shù)線之外的培養(yǎng)液內(nèi)外擴散生長發(fā)育使培養(yǎng)液呈渾濁狀況；無驅(qū)動力的病菌僅能沿穿刺術(shù)線生長發(fā)育，不向擴散，培養(yǎng)液仍呈清楚全透明狀；無驅(qū)動力主要表現(xiàn)的塑造物，應(yīng)在室內(nèi)溫度保存2～三天后，再次觀查。沙門氏菌除雛雞沙門氏菌及無驅(qū)動力的變異外，均具備全身微絨毛，能健身運動，驅(qū)動力實驗呈陽性。沙門氏菌生化反應(yīng)的基本辨別見下表。
表4 沙門氏菌與相關(guān)病菌在三糖鐵瓊脂及基本生物化學(xué)實驗的辨別
| 編號 |
|
靛栽培基質(zhì) |
脲酶 |
氰化鉀 |
磷酸氫鈣脫羧酶 |
判斷菌屬 |
|||
| 斜坡 |
最底層 |
脹氣 |
氯化氫 |
||||||
| 1.1 |
－ |
＋ |
＋／－ |
＋／－ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
沙門氏菌屬 |
| 1.2 |
＋／－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
沙門氏菌屬III |
| 2 |
－ |
＋ |
＋／－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
遲緩愛得華菌屬 |
| 3 |
＋／－ |
－ |
＋／－ |
＋／－ |
－／＋ |
－／＋ |
＋／－ |
－ |
弗勞地檸檬酸鈉鏈球菌 |
| 4.1 |
－ |
＋ |
＋S |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
奇特變形桿菌 |
| 4.2 |
－ |
＋ |
＋／－S |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
一般變形桿菌 |
| 5 |
＋／－ |
＋ |
＋／－ |
－ |
＋／－ |
－ |
－ |
＋／－ |
大腸埃希菌 |
| 6 |
－ |
＋ |
－ |
－ |
－／＋ |
－ |
－ |
－ |
志賀菌屬 |
| 7.1 |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋／－ |
＋ |
－ |
陰溝腸桿菌 |
| 7.2 |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋／－ |
＋ |
＋ |
肺部感染克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌 |
| 8 |
－ |
＋ |
＋S／－ |
－ |
＋ |
＋／－ |
＋ |
－ |
普羅菲登斯菌屬、麥考利菌屬 |
| 9 |
－ |
＋ |
＋／－ |
－ |
－ |
－／＋ |
＋ |
＋ |
蜂巢哈夫犬菌、黏質(zhì)沙雷菌 |
對于三糖鐵瓊脂上的反映，＋產(chǎn)酸（淡黃色），陽性，陽性率，＞90％；－產(chǎn)堿（鮮紅色），陰性，陰性率，＞90％；＋／－大部分陽性、極少數(shù)陰性；＋S造成小量汽體；生物化學(xué)試驗的結(jié)果參照此章6.5內(nèi)容；＋陽性，陽性率，＞90％；－陰性，陰性率，＞90％；＋／－大部分陽性、極少數(shù)陰性，－／＋大部分陰性、極少數(shù)陽性（此表根據(jù)何曉青疾病預(yù)防病菌檢測，參照第八版《美國臨床微生物手冊》，反映序號1除典型性反映外，脲酶、氰化鉀試驗、磷酸氫鈣脫羧酶試驗三項中有一項出現(xiàn)異常；反映編號2僅靛栽培基質(zhì)陽性；可融合血清學(xué)凝結(jié)試驗，或加做一部分生物化學(xué)試驗，判斷是不是為沙門氏菌，別的狀況可清除沙門氏菌。
6.6 血清學(xué)凝結(jié)試驗
6.6.1 提前準(zhǔn)備1片清潔的殺菌蓋玻片，在近中間的一端，以直徑3毫米接種環(huán)沾取沙門氏菌屬0鞭毛抗原1血清蛋白2～3環(huán)做成與裝片厚徑相豎直的條型擦抹，約長1.5厘米，寬約0.5厘米。另一端用鹽水替代血清蛋白同法實際操作，做為陰性對比。
6.6.2 用接種環(huán)各自挑取三糖鐵瓊脂斜坡或營養(yǎng)成分瓊脂斜坡的新鮮塑造物少量，在血清蛋白和食鹽水中攪拌。菌量要適度，勿太濃。
6.6.3 將裝片前后左右歪斜多次，以深色情況襯底，在優(yōu)良的照明燈具標(biāo)準(zhǔn)下開展觀查，陰性對比不發(fā)生凝結(jié)狀況，試驗組一切水平的凝結(jié)狀況全是陽性反映。陽性反映一般 在3min內(nèi)產(chǎn)生。有時候因血清蛋白效價低、反映緩慢時，應(yīng)將裝片置細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，并放一個濕藥棉在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)約20min，再觀查結(jié)果。假如依然沒有發(fā)生凝結(jié)，應(yīng)取斜坡塑造物，置含小量鹽水的試管嬰兒中，做成濃菌懸液，在100℃水浴中隔熱保溫30min，以去除很有可能存有的Vi抗原體，待冷，再做凝結(jié)試驗，如發(fā)生凝結(jié)，仍算為陽性反映；如不發(fā)生凝結(jié)狀況，則為陰性反映。
6.6.4 如對比試驗發(fā)生凝結(jié)狀況為特異反映，須對該菌種塑造物開展解決后再作凝結(jié)試驗。
7 結(jié)果分辨
7.1 供試品塑造物為革蘭陰性鏈球菌，三糖鐵瓊脂反映及生化反應(yīng)合乎沙門氏菌屬反映，沙門氏菌屬0鞭毛抗原1血清蛋白凝結(jié)試驗陽性反映（含待檢塑造物經(jīng)l00℃30min解決后凝結(jié)試驗為陽性反映），匯報20g或10ml供試IQC出沙門氏菌。
7.2 供試品塑造物三糖鐵瓊脂反映或生化反應(yīng)不符沙門氏菌屬反映及沙門氏菌屬0鞭毛抗原1血清蛋白凝結(jié)試驗為陰性反映（含待檢塑造物經(jīng)100℃30min解決后凝結(jié)試驗為陰性反映），匯報1g或1ml供試品未驗出沙門氏菌。
7.3 供試品塑造物發(fā)生以下狀況應(yīng)再次評定或保存菌苗提交相關(guān)企業(yè)進(jìn)一步評定后，再匯報工作。
7.3.1 供試品塑造物生化反應(yīng)合乎沙門氏菌屬反映，沙門氏菌屬0鞭毛抗原1血清蛋白凝結(jié)試驗陰性反映。
7.3.2 供試品塑造物生化反應(yīng)不符沙門氏菌屬反映，沙門氏菌屬0鞭毛抗原1血清蛋白凝集反應(yīng)呈陽性反映。
7.4 對已驗出沙門氏菌的供試品分離出來菌苗，有條件者，應(yīng)進(jìn)一步作菌型評定。依據(jù)驗出菌的特點，推論很有可能菌型，提升生物化學(xué)試驗新項目及沙門氏菌單因素血清蛋白“O”及“H”凝結(jié)試驗開展評定。
8 常見問題
8.1 試驗用培養(yǎng)液，需歷經(jīng)品質(zhì)評定，用已經(jīng)知道典型性反映菌種（如乙型肝炎副傷寒沙門菌[CMCC(B) 50094]開展檢測，其敏感度及特征反映應(yīng)符合規(guī)定。培養(yǎng)液需要在要求標(biāo)準(zhǔn)儲存，在要求時間內(nèi)應(yīng)用。分離出來平板電腦在應(yīng)用前應(yīng)置30～35℃溫箱里顛倒孵育1～1h，使其表層溫暖潮濕，有利于分離出來沙門氏菌。
8.2 在對供試品開展檢測的另外，需要陽性菌對比及陰性對比。陰性對呼應(yīng)無菌檢測生長發(fā)育，陽性對呼應(yīng)表明陽性結(jié)果，不然檢測結(jié)果失效。在開展陽性菌對比試驗時，應(yīng)與供試品檢測分離實際操作，防止環(huán)境污染。尤其是用接種環(huán)沾取菌液開展打疫苗或分離出來時，防止姿勢過大，產(chǎn)生大氣氣溶膠，環(huán)境污染供試品檢測用品及實際操作自然環(huán)境。
8.3 為確保試驗方式的穩(wěn)定性，對分離出來平板電腦上的疑是菌體，應(yīng)多選擇好多個菌體另外開展試驗。挑取菌體時，不要在分離出來平板電腦菌體聚集位置挑取異常菌體，而應(yīng)在菌體遍布稀少位置選擇。
8.4 生物化學(xué)試驗及血清學(xué)試驗的被評定塑造物務(wù)必是純塑造物，不然，不太可能獲得恰當(dāng)結(jié)果。如遇血清學(xué)凝結(jié)試驗陽性而生物化學(xué)試驗不符時，應(yīng)最先查驗塑造物的純凈度。對已環(huán)境污染的塑造物，不可丟掉，由于環(huán)境污染菌很有可能遮蓋沙門氏菌，故解決被環(huán)境污染的塑造物再次分離出來，細(xì)心選擇單獨菌體再開展試驗。
8.5 全部生化反應(yīng)均需依照要求的試驗規(guī)定開展，如觀查三糖鐵瓊脂斜坡反映的時間，應(yīng)在24士1h，時間過短太長，都很有可能發(fā)生不正確結(jié)果分辨。又如氰化鉀試驗，試管嬰兒口應(yīng)密塞，不然氰化鉀濃度值減少，導(dǎo)致殺菌作用降低，造成不正確的判斷結(jié)果。
8.6 血清蛋白凝結(jié)試驗的影響因素甚多，除與電解質(zhì)溶液、pH、溫度相關(guān)外，須需注意抗原體與抗原使用量的占比適當(dāng)，僅有當(dāng)二者濃度值適度時，凝集反應(yīng)方顯著由此可見。因為此方法試驗用鞭毛抗原血清蛋白，其凝集力相對性較差，試驗用菌液量切不可以過大。檢測前，運用已經(jīng)知道陽性菌檢測以把握適合菌液濃度值。
8.7 沙門氏菌為腸胃關(guān)鍵病原菌，實際操作時要需注意避免 分離出來待檢菌及陽性對比菌對實際操作自然環(huán)境及試驗的環(huán)境污染。全部使用過的增菌、分離出來、生物化學(xué)試驗培養(yǎng)液、血清學(xué)凝結(jié)試驗及上色鏡檢查后的裝片等，均需經(jīng)殺菌后才能清洗。
（四）銅綠假單胞菌
1 概述
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），習(xí)稱綠膿桿菌，為假單胞菌屬菌苗，普遍遍布在土壤層，水及氣體，動物和人的肌膚、腸胃、呼吸系統(tǒng)均有存有，故可根據(jù)自然環(huán)境和生產(chǎn)制造的各個階段環(huán)境污染藥物。本菌是普遍的生膿性感柒菌、在燙傷、燒傷，骨科以及他普外疾病中常會造成繼發(fā)感染，因為本菌對很多抗菌藥具備純天然的抗藥性，提升了醫(yī)治的難度系數(shù)、世界各國中國藥典均將銅綠假單胞菌查驗列入檢查項目之一。銅綠假單胞菌按增菌、分離出來、純塑造、革蘭氏染色鏡檢查及生物化學(xué)實驗等流程開展檢測。
2 儀器設(shè)備、機器設(shè)備和用品（見腸子埃希茵檢測法2）
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)示液
3.1 0.9%無菌檢測氯化鈉溶液或聚磷酸鹽緩沖溶液（配件二3.1，3.3）
3.2 1%二硫酸二甲基對苯二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.1）
3.3 硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（配件二2.12）
3.4 三氯甲烷（配件二1.57）
4 培養(yǎng)液
4.1 營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液（配件二5.1）
4.2 膽鹽乳清蛋白（BL）培養(yǎng)液（配件二5.6）
4.3 營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.2）
4.4 溴代十六烷基三甲胺（配件二5.14）
4.5 綠膿菌素測量用培養(yǎng)液（PDP瓊脂）（配件二5.26）
4.6 果膠培養(yǎng)液（配件二5.27）
4.7 磷酸鹽胨水培養(yǎng)液（配件二5.28）
5 對比用菌液
銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10104]營養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物少量，打疫苗至10ml營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液內(nèi)，于30～35℃塑造18～24小時后，用0.9％無菌檢測氯化鈉溶液按10倍增長稀釋液濃度值等同于10～一百個cfu／ml，作陽性對照用菌液。其菌液濃度值可在做陽性對照試驗的另外用平板電腦菌落計數(shù)法測出。
6 操作步驟
6.1 供試品的抽樣量[見病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)6]
6.2 供標(biāo)準(zhǔn)溶液的制取[見病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)7]
6.3 增菌塑造
取膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液3份，每一份100ml，1份添加1:10供標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml（等同于供試品1g或1ml）；1份添加供標(biāo)準(zhǔn)溶液及陽性對照菌；l份添加與供標(biāo)準(zhǔn)溶液相等的油漆稀釋劑作陰性對照。于30～35℃塑造18～24小時（必需時可延到48h）。陰性對照菌應(yīng)無菌檢測生長發(fā)育。
6.4 分離出來塑造
輕輕地?fù)u晃以上增菌細(xì)胞培養(yǎng)液，以接種環(huán)取1～2環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)液（若有菌膜應(yīng)挑取之），畫線打疫苗于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板電腦，于30～35℃塑造18～24小時。銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)液平板電腦上的典型性菌體為平扁、環(huán)形或不定形、邊沿參差不齊，光潔潮濕，呈灰白，附近略呈擴散現(xiàn)象，在菌體鄰近處經(jīng)常出現(xiàn)結(jié)合狀況。菌體周邊經(jīng)常出現(xiàn)水溶深藍(lán)色素外擴散，使培養(yǎng)液顯深藍(lán)色，但亦有不產(chǎn)黑色素的菌種。菌體也有不光滑型和粘液型等，應(yīng)留意選擇。
6.5 純塑造
供試品分離出來平板電腦生長發(fā)育6.4上述典型性菌體或呈疑是菌體時，以接種針輕輕地觸碰單獨菌體的表層管理中心，沾取塑造物，應(yīng)挑取2～3個疑是菌體，各自打疫苗營養(yǎng)成分瓊脂斜坡，塑造，作下列查驗。
6.6 革蘭氏染色鏡檢查
6.6.1 革蘭氏染色（見大腸埃希菌查驗6.5）
6.6.2 鏡檢查
銅綠假單胞菌為革蘭呈陰性、無枯草芽孢菌，單獨，成雙或成挎包排序。
6.7 生物化學(xué)實驗
可以用銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10104]做生物化學(xué)實驗的陽性對照株。
6.7.1 抗霉素實驗
取一小塊乳白色清潔的過濾紙置平皿內(nèi)，以無菌檢測玻璃棒挑取營養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物少量，涂在過濾紙上，隨后滴入1滴新配置的1％二硫酸二甲基對苯二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在30s內(nèi)，紙條上的塑造物發(fā)生淡粉色，慢慢變成暗紫色，即是抗霉素實驗陽性反應(yīng)。若塑造物不掉色或僅顯粉紅色為陰性反應(yīng)。
本實驗應(yīng)留意：
（1）實驗菌體（苔）務(wù)必新鮮，老舊塑造物反映結(jié)果不靠譜。
（2）實驗防止與鐵、鎳等金屬材料觸碰，不能用一般接種針（環(huán)）（鉑金原材料以外）挑取菌（苔），不然易發(fā)生陽性。宜用玻璃棒或木棍。
（3）實驗試劑宜新鮮配置，置放太久，二硫酸二甲基對苯二胺空氣氧化掉色不能用。
（4）反映需要在有氧運動標(biāo)準(zhǔn)下開展，勿滴入實驗試劑太多，以防泡浸塑造物使之與氣體阻隔，導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。
（5）麥康凱、SS培養(yǎng)液等含糖量培養(yǎng)液上的菌體不適合做抗霉素實驗，由于糖溶解產(chǎn)酸抑止抗霉素特異性。
6.7.2 綠膿菌素實驗
取營養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物打疫苗于綠膿菌素測量用培養(yǎng)液（PDP）斜坡上，30～35℃塑造24小時后，觀查斜坡有沒有黑色素，若有黑色素，在試管嬰兒里加三氯甲烷3～5ml，以無菌檢測玻棒絞碎培養(yǎng)液并充足振搖。使塑造物中的黑色素徹底提純在三氯甲烷內(nèi)。靜放一會兒，待三氯甲烷分層次，用塑料吸管將三氯甲烷挪到另一試管嬰兒中，添加硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mol／L）約1ml，振搖后靜放一會兒，如在硫酸液層內(nèi)發(fā)生淡粉色、即是陽性反應(yīng)，無淡粉色發(fā)生為陰性反應(yīng)。本實驗可以用未打疫苗的PDP瓊脂培養(yǎng)液斜坡作陰性對照，陰性對照實驗理應(yīng)呈呈陰性。如培養(yǎng)液斜坡無黑色素造成，應(yīng)于室內(nèi)溫度塑造l～2天再按上法實驗。凡經(jīng)再度檢測，綠膿菌素實驗仍為呈陰性者應(yīng)再次下列實驗。
6.7.3 磷酸鹽還原產(chǎn)地氣實驗
以接種環(huán)沾取少量營養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物打疫苗于磷酸鹽胨水培養(yǎng)液中，置30～35℃塑造24小時，觀查結(jié)果。假如在培養(yǎng)液內(nèi)的小倒管內(nèi)有汽體造成，即是陽性反應(yīng)，說明該塑造物能復(fù)原磷酸鹽，并將亞硝酸鈉溶解造成N2。小倒管中沒有氣泡者為陰性反應(yīng)。
6.7.4 42℃生長發(fā)育實驗
以接種環(huán)沾取少量營養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物于0.9％無菌檢測氯化鈉溶液中，做成菌懸液。隨后將菌懸液畫線打疫苗于營養(yǎng)成分瓊脂斜坡上，馬上置41℃士1℃的恒溫水浴箱內(nèi)，務(wù)使全部斜坡浸入在水浴中，塑造24～48h，斜坡若有菌苔生長發(fā)育者為陽性反應(yīng)；無菌苔生長發(fā)育為陰性反應(yīng)。
6.7.5 明膠液化實驗
以接種針沾取營養(yǎng)成分瓊脂斜坡塑造物少量，穿刺接種于果膠培養(yǎng)液中，穿刺術(shù)深層應(yīng)貼近培養(yǎng)液的底端，于30～35℃塑造24小時。取下放進(jìn)0～4℃電冰箱內(nèi)10～30min。如培養(yǎng)液呈水溶液狀，即是明膠液化實驗陽性反應(yīng)；如果膠呈凝結(jié)狀，為陰性反應(yīng)。
本實驗應(yīng)留意：
（1）本實驗打疫苗前，培養(yǎng)液應(yīng)是固體，不然需將培養(yǎng)液置電冰箱內(nèi)使之凝結(jié)后，再穿刺接種。
（2）實驗應(yīng)另外設(shè)未打疫苗病菌的陰性對照管，與實驗管另外塑造并觀查結(jié)果。
7 結(jié)果匯報
7.1 供試品塑造物經(jīng)確認(rèn)為革蘭呈陰性鏈球菌，抗霉素實驗及綠膿菌素實驗皆為陽性者，即匯報1g或1ml供試IQC出銅綠假單胞菌。
7.2 供試品塑造物抗霉素實驗呈陽性，鏡檢查為革蘭呈陰性鏈球菌的塑造物，綠膿菌素實驗呈陰性時，其磷酸鹽還原產(chǎn)地氣實驗、42℃生長發(fā)育實驗及明膠液化實驗皆為呈陽性時，亦匯報1g或1ml供試IQC出銅綠假單胞菌。
7.3 凡與7.1與7.2結(jié)果不符合時，匯報1g或1ml供試品未驗出銅綠假單胞茵。
8 常見問題
8.1 銅綠假單胞菌環(huán)境污染藥物后，因生產(chǎn)工藝流程和藥品的危害，在溴代十六烷基三甲胺平板電腦上的菌體形狀可造成非典型形狀。為避免 漏驗，在挑取疑是菌體時，宜取2～3個之上菌體，各自開展檢測，以提升 銅綠假單胞菌的診斷率。
8.2 綠膿菌素是銅綠假單胞菌評定的關(guān)鍵特點，但黑色素的造成受很多要素的危害，除菌種差別及基因變異外，塑造標(biāo)準(zhǔn)是關(guān)鍵要素，溫度、培養(yǎng)液成份等皆可危害黑色素造成。培養(yǎng)液中瓊脂、蛋白胨等均應(yīng)事前檢測，采用適合知名品牌，實驗時并且用呈陽性菌種作對比實驗。
（五）橙黃色鏈球菌
1 概述
橙黃色鏈球菌（Staphylococcus aureus）為鏈球菌屬中的一種，普遍遍布于大自然。氣體、土壤層、水及物件上，動物和人肌膚及與外部互通的腔道中，也常常有本菌存有。本菌可造成多種多樣內(nèi)毒素及酶，這種毒副作用化學(xué)物質(zhì)能造成部分及全身上下生膿性發(fā)炎，比較嚴(yán)重時可發(fā)展趨勢變成敗血病和膿毒血癥，是人們生膿性感柒中關(guān)鍵的病菌。本菌抵抗能力較強，干躁狀況下會存活數(shù)月，80℃30min的標(biāo)準(zhǔn)下行遠(yuǎn)必自生存，5％石碳酸或0.1％升汞水溶液10～15min才會被殺掉。
橙黃色鏈球菌查驗按增菌、分離出來、純塑造、革蘭氏染色鏡檢查和血液凝結(jié)酶實驗等流程開展。此方法適用外敷藥物及一般滴眼劑、眼膏藥的查驗。
2 儀器設(shè)備、機器設(shè)備及用品（見大腸埃希菌檢測法2）
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)示液
3.1 0.9％無菌檢測氯化鈉溶液或無菌檢測聚磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）（配件二3.1，3.3）
3.2 革蘭氏染色液（配件二2.4，2.10，2.16）
3.3 無菌檢測枸櫞酸鈉氯化鈉溶液（配件二2.7）
3.4 血液的制取
以無菌檢測注射針汲取殺菌的含5％枸櫞酸鈉的0.9％的氯化鈉溶液1ml，用無菌操作原則采用家兔（或羊、人）血8ml，輕輕地攪拌幾分鐘。待血夜不凝結(jié)時，緩緩放進(jìn)殺菌離心管中，抽濾（500 r／min抽濾5min），分離出來血液，用殺菌塑料吸管將血液遷移至殺菌試管嬰兒中，置電冰箱預(yù)留。臨用前務(wù)必用已經(jīng)知道血液凝結(jié)酶實驗呈陽性的橙黃色鏈球菌（如橙黃色鏈球菌[CMCC(B) 26003]）檢測，證實血液達(dá)標(biāo)后，即可用以試驗。
3.5 1％酚磺酞標(biāo)示液（配件二4.4）
4 培養(yǎng)液
4.1 營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液（配件二5.1）
4.2 營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.2）
4.3 亞碲磷酸鹽骨頭湯培養(yǎng)液（配件二5.15）
4.4 卵黃氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.16）
4.5 甘露醇氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.17）
5 對比用菌液
取橙黃色鏈球菌[CMCC(B) 26003]營養(yǎng)成分瓊脂斜坡新鮮塑造物少量，打疫苗至10ml營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液中，30～35℃塑造18～24小時，用0.9％無菌檢測氯化鈉溶液按10倍增長稀釋液濃度值等同于10～100cfu／ml，作陽性對照用菌液。其菌液濃度值可在做陽性對照試驗的另外用平板電腦菌落計數(shù)法測出。（見方式認(rèn)證用規(guī)范菌種2.4）
6 操作步驟
6.1 供試品的檢測量[見病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)6]
6.2 供標(biāo)準(zhǔn)溶液的制取[見病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)7]
6.3 增菌培養(yǎng)
取營養(yǎng)成分肉湯（或亞碲酸鈉緩釋片肉湯）培養(yǎng)基3份，每一份100ml，1份添加10ml供試液，1份添加供試液及陽性對照菌，1份添加與供試液相等的0.9%無菌氯化鈉溶液或聚磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）做為陰性對照，置30～35℃培養(yǎng)18～24小時（必需時可延到48h）。陰性對照應(yīng)無菌生長發(fā)育。
6.4 分離出來培養(yǎng)將以上供試品增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液，畫線打疫苗于卵黃氧化鈉瓊脂平板電腦或甘露醇氧化鈉瓊脂平板電腦上，置30～35℃培養(yǎng)24～72h。當(dāng)供試品分離出來平板電腦無菌落生長發(fā)育，或有菌體生長發(fā)育但有別于下列列出特點，可匯報為1g或1ml供試品未驗出橙黃色鏈球菌。
表5 橙黃色鏈球菌在三種可選擇性培養(yǎng)基上菌體形狀特點
| 培養(yǎng)基 |
菌體形狀特點 |
| 卵黃鈦酸異丙酯納瓊脂 |
橙黃色，環(huán)形突起，邊沿齊整，光潔潮濕，頸靜脈有溶解大豆卵磷脂后造成的乳濁圈，菌體直徑1～2毫米 |
| 甘露醇鈦酸異丙酯納瓊脂 |
橙黃色，環(huán)形突起，邊沿齊整．光潔潮濕．頸靜脈有淡黃色環(huán)。菌體直徑0.7～1毫米 |
6.5 純培養(yǎng)
當(dāng)供試品分離出來平板電腦生長發(fā)育菌體與表1列出菌體特點類似或疑是時，應(yīng)選擇2～3個之上菌體，各自用接種針，輕輕地沾取菌體管理中心表層培養(yǎng)物，打疫苗于營養(yǎng)成分瓊脂斜坡上，于30～35℃培養(yǎng)18～24小時，取營養(yǎng)成分瓊脂斜坡培養(yǎng)物作革蘭氏染色、鏡檢查及打疫苗營養(yǎng)成分瓊脂肉湯于30～35℃培養(yǎng)18～24小時做血液凝結(jié)酶實驗。
6.6 革蘭氏染色、鏡檢查
6.6.1 革蘭氏染色（見大腸埃希菌檢測法6.5）
6.6.2 鏡檢查橙黃色鏈球菌為革蘭呈陽性革蘭陰性桿菌，無芽胞，一般不造成莢膜。排序呈不規(guī)律的紅提狀，也可以呈單獨、成雙成對或短網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)排序。
6.7 血液凝結(jié)酶實驗
試管嬰兒法：取無菌試管嬰兒（11mm×100毫米）3支，各添加血液和0.9％無菌氯化鈉溶液（1:1）0.5ml，1支添加瓊脂斜坡培養(yǎng)物菌懸液（或被檢菌的營養(yǎng)成分肉湯培養(yǎng)液）0.5ml，其他2支對著干照料：1支添加橙黃色鏈球菌[CMCC(B) 26003]培養(yǎng)物菌懸液或營養(yǎng)成分肉湯培養(yǎng)液0.5ml做為陽性對照；另一支添加營養(yǎng)成分肉湯或0.9％無菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對照。三管另外置37℃水浴或控溫培養(yǎng)箱，3h后逐漸查驗，之后每過適度時間觀查一次，直到24小時。查驗時，輕輕地將試管嬰兒歪斜（姿勢勿大），認(rèn)真觀察，陰性對照管血液流動性輕松，陽性對照管血液呈凝結(jié)狀，實驗管呈凝結(jié)者為陽性反應(yīng)；不凝結(jié)為陰性反應(yīng)。陽性對照管和陰性對照管一切一管不符合規(guī)定時，應(yīng)另制取血液，再次實驗。
7 結(jié)果分辨
假如革蘭氏染色結(jié)果清楚靠譜（必需時加做已經(jīng)知道革蘭氏染色結(jié)果的病菌開展上色質(zhì)量管理），凝結(jié)酶實驗陰性對照實驗呈呈陰性，陽性對照實驗呈陽性結(jié)果，供試品培養(yǎng)物按以下工作方案或解決：
7.1 疑是菌革蘭氏染色呈陽性革蘭陰性桿菌，血液凝結(jié)酶實驗陽性反應(yīng)者，匯報1g或1ml供試IQC出橙黃色鏈球菌（少量菌種很有可能并不是橙黃色鏈球菌只是鏈球菌屬的別的菌苗）。
7.2 革蘭氏染色鏡檢查并不是革蘭呈陽性革蘭陰性桿菌，或血液凝結(jié)酶實驗陰性反應(yīng)，匯報1g或1ml供試品未驗出橙黃色鏈球菌。
7.3 陰性對照有菌生長發(fā)育，實驗結(jié)果失效。
7.4 陽性對照實驗呈呈陰性結(jié)果，理應(yīng)加做認(rèn)證實驗，調(diào)查檢品是不是有抗菌特異性。
8 常見問題
8.1 橙黃色鏈球菌在以上二種分離出來培養(yǎng)基上的典型性菌體為橙黃色。但因為受藥品危害或非典型菌種存有，也可以呈橘黃色、杏黃色或乳白色。做操縱菌查驗，對非典型菌體也必須開展凝結(jié)酶實驗做橙黃色鏈球菌的篩選，防止漏驗橙黃色鏈球菌。培養(yǎng)基儲放時間和培養(yǎng)時間危害黑色素造成，故培養(yǎng)基應(yīng)新鮮配置。培養(yǎng)時間宜48h之上。
8.2 假如應(yīng)用干躁培養(yǎng)基，應(yīng)按使用說明配置，留意pH值是不是符合要求，必需時要校準(zhǔn)pH后殺菌應(yīng)用。
8.3 血液凝結(jié)酶實驗運用新鮮培養(yǎng)物及新鮮血液。如用老舊培養(yǎng)物及血液（游離脂肪酸常已進(jìn)行析出）易造成假陰性反應(yīng)。除此之外，觀查結(jié)果時不必?fù)u晃試管嬰兒，因凝結(jié)前期稠狀易毀壞，造成假陰性實驗。
8.4 鏈球菌屬在新版本《Bergey手冊》中國共產(chǎn)黨載于為28種，在微生物評定中現(xiàn)階段運用較多的2003年出版發(fā)行的第八版《美國臨床微生物手冊》收錄于35個菌苗，44個菌型。普遍有橙黃色鏈球菌與外皮鏈球菌、腐生鏈球菌3種?？蓞⒖枷卤黹_展評定。在其中又以橙黃色鏈球菌和外皮鏈球菌的辨別更為關(guān)鍵。
表6 3種鏈球菌的關(guān)鍵特性
| 特性 |
橙黃色鏈球菌 |
外皮鏈球菌 |
腐生鏈球菌 |
| 菌體黑色素 |
關(guān)鍵為橙黃色 |
關(guān)鍵為乳白色 |
關(guān)鍵為杏黃色 |
| 尺寸（菌體直徑） |
0.8～1.0Mm |
0.5～1.5毫米 |
0.5～1.5毫米 |
| α溶血癥內(nèi)毒素 |
＋ |
－／非常少＋ |
－ |
| 甘露醇 |
|
|
|
| 需氧 |
＋ |
d |
d |
| 厭氧發(fā)酵 |
＋ |
－ |
－ |
| 凝結(jié)酶 |
＋ |
－ |
－ |
| 卵黃反映 |
＋ |
－ |
－ |
| 耐高溫DNA酶 |
＋ |
－ |
－ |
| 對新生兒菌素敏感度 |
S |
S |
R |
| 噬菌體分析 |
大部分能分析 |
不可以分析 |
不可以分析 |
| A蛋白質(zhì) |
＋ |
－ |
－ |
| 高致病 |
強 |
弱或無 |
無 |
d結(jié)果不確定性，S比較敏感，R抗藥性
8.5 現(xiàn)階段商業(yè)化的橙黃色鏈球菌檢測試劑好幾家微生物菌種有關(guān)中藥制劑企業(yè)有銷售，實驗試劑具備不錯的可靠性、精確性。商業(yè)化的檢測試劑理應(yīng)在適度的標(biāo)準(zhǔn)下儲存，在有效期限內(nèi)運用。
（六）梭菌
1 概述
梭菌屬（Clostridium）以往稱之為梭狀枯草芽孢菌屬，菌體1um×5um上下的革蘭呈陽性鏈球菌，能產(chǎn)生芽胞。芽胞多超過菌體的總寬，病菌澎漲呈梭形，故稱梭狀枯草芽孢菌。該菌屬中關(guān)鍵病菌有脹氣莢膜梭菌(C.perfringens)、破傷風(fēng)梭菌（C.tetani）、肉毒梭菌（C.botulinum）和艱難梭菌（C.difficile），均能造成明顯的外毒素使動物和人發(fā)病。因而，針對一些用以陰道內(nèi)、外傷、潰爛的藥物，務(wù)必操縱梭菌。
查驗梭菌的方式主要是增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)和鏡檢查形狀觀查，必需時做分離出來培養(yǎng)后再次評定。
2 儀器設(shè)備、機器設(shè)備及用品
2.1 玻璃容器
試管嬰兒（30mm×200mm）等。清洗整潔，沒有殘留抑菌化學(xué)物質(zhì)，捆扎后，殺菌預(yù)留[見病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)]。
2.2 天平秤、離心脫水機、光學(xué)顯微鏡、髙壓滅菌設(shè)備、干燥烘箱[見病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)]。
2.2.1 天平秤、髙壓滅菌設(shè)備、干燥烘箱等應(yīng)按時開展校檢。
2.2.2 厭氧發(fā)酵培養(yǎng)袋、箱（罐）等（有產(chǎn)品供貨），經(jīng)檢測后采用。
2.3 清潔試驗室或超凈工作臺[見病菌、黃曲霉菌(酵母)記數(shù)2.1.1]。
2.4 手術(shù)治療鑷、手術(shù)治療剪及抽樣匙，應(yīng)嚴(yán)實捆扎，殺菌預(yù)留。
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液
3.1 革蘭氏染色液（配件二2.10，2.16，2.4）
3.2 厭氧發(fā)酵顯色劑（配件二4.8）
3.3 3％雙氧水水溶液
3.4 75％乙醇溶液
3.5 碘酊水溶液或碘伏消毒液
3.6 0.9％無菌檢測氯化鈉溶液（配件二3.1）
3.7 苯扎溴銨（1:1000）水溶液
4 培養(yǎng)液
4.1 硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)液（配件二5.33）
4.2 梭菌增菌培養(yǎng)液（配件二5.29）
4.3 澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液（含青霉素50mg／L和沒有青霉素）（配件二5.30）
5 對比用菌液
生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B) 64941]。
菌液制取 取生孢梭菌打疫苗至12ml硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)液中，置30～35℃塑造18～24小時，用0.9%無菌檢測氯化鈉溶液做成1ml含10～100cfu的菌液。生孢梭菌規(guī)范菌液記數(shù)可用1ml含100～1000cfu的菌液0.1ml施膠于澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液平板電腦置厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)下塑造48～72h記數(shù)；還可以取1ml含10～100cfu的菌液1ml打疫苗于不少于12ml硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)液中，混勻，置30～35℃塑造18～20h記數(shù)在其中的小燈籠狀菌團，一般狀況時該小燈籠狀菌團數(shù)與平板電腦記數(shù)菌體數(shù)非常。[見方式認(rèn)證2.4]
生孢梭菌菌苗的儲存可用其硫乙醇酸鹽液體塑造物攪拌、凍存管散裝、低溫儲存（如－80℃），用時取下當(dāng)然解除凍結(jié)、經(jīng)硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)液再生、促根，制取新鮮塑造物應(yīng)用。
6 操作步驟
6.1 不一樣制劑試品的前解決
6.1.1 藥粉去除包裝，立即稱量規(guī)定量的試品就可以。
6.1.2 膠襄去除包裝，連殼一起稱量規(guī)定量試品。
6.1.3 軟膏劑及栓劑稱量試品20g，按病菌、黃曲霉菌、(酵母)記數(shù)6.23要求的適合方式乳狀液，乳狀液后添加加熱至45℃的0.9％無菌檢測氯化鈉溶液，做成1:20供標(biāo)準(zhǔn)溶液。
6.2 增菌塑造
6.2.1 厭氧發(fā)酵塑造設(shè)備的提前準(zhǔn)備除產(chǎn)品厭氧發(fā)酵塑造袋、箱、罐按使用說明書規(guī)定提前準(zhǔn)備外，試驗室也可以用真空干燥器、標(biāo)本瓶或別的適合器皿取代應(yīng)用，可采用以下一種方式制取厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)：
6.2.1.1 冷觸媒法 臨用前，取試管嬰兒或別的適合器皿3支，1支稱入硼氫化鈉0.22g（以厭氧發(fā)酵塑造器皿容量1L計），1支稱取枸櫞酸0.33g、碳酸氫納0.37g，另1支放進(jìn)經(jīng)活性的鈀粒約1g，與打疫苗后的供試品塑造管（或平板電腦）及厭氧發(fā)酵顯色劑管1支，另外放置厭氧發(fā)酵塑造器皿內(nèi)，隨后各放水5ml于前2立管（或器皿）中，快速密封性器皿蓋。鈀粒為遮蓋鈀的三氧化二鋁的球形或條形顆粒物（有商品出售），用前需經(jīng)160℃干烤1h，或在加熱爐上燒灼5min使其活性。因為每用1次便喪失催化反應(yīng)性，因而，再度應(yīng)用時要按上法活性后才能應(yīng)用。將鈀粒多個置室內(nèi)溫度水里，附帶很多汽泡者為特異性優(yōu)良，可立即應(yīng)用。此方法可做為鈀粒的特異性查驗。
6.2.1.2 焦性沒食子酸法用前，取細(xì)胞培養(yǎng)皿或別的適合器皿1支，添加焦性沒食子酸20g及無水碳酸鈉5G（以厭氧發(fā)酵器皿容量1L計），與打疫苗后的供試品塑造管（或平板電腦）及厭氧發(fā)酵顯色劑管1支另外放置厭氧發(fā)酵器皿內(nèi)，快速密封性器皿蓋。
6.2.2 增菌塑造 取供標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml（等同于供試品1g、1ml）4份，其中2份置80℃隔熱保溫10min后快速制冷。以上4份供標(biāo)準(zhǔn)溶液立即或解決后各自打疫苗至100ml的梭菌增菌培養(yǎng)液中，其中2份（立即1份，解決后1份）梭菌增菌塑造管內(nèi)各自添加陽性對照菌（10～100cfu）。置厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)下塑造48h。
6.3 分離出來塑造取以上每一塑造物0.2ml，各自擦抹打疫苗于含青霉素的澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液平板電腦上，置厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)下塑造48～72h。若供試品平板電腦上無菌檢測落生長發(fā)育，判供樣品未驗出梭菌；若供試品平板電腦上面有菌體生長發(fā)育，應(yīng)選擇2～3個菌體各自開展革蘭氏染色和酶活性實驗。
6.4 革蘭氏染色鏡檢查取疑是菌體玻片，作革蘭氏染色、鏡檢查，觀查上色及菌體特點。本菌形狀特點比較典型性。塑造后產(chǎn)生的芽胞，初呈“火柴頭”狀橢圓狀，進(jìn)而彭大呈球型，在菌體尾端如鼓槌狀。塑造時間至72h之上時，菌體可自溶而消退，僅見分散的芽胞囊，一般上色時呈圓形狀。上色鏡檢查有橢圓狀至球型的芽胞，超過菌體，著生在菌體中間、次端或頂部，為梭菌典型性形狀。
6.5 酶活性實驗 加一滴3％雙氧水水溶液至瓊脂表層的單獨分散化的菌體，或遷移至蓋玻片上的菌體上。有汽泡產(chǎn)生表明酶活性反映呈陽性，梭菌應(yīng)成呈陰性結(jié)果?？梢杂每莶菘莶菅挎呔鰹殛栃苑磻?yīng)對比菌。
7 結(jié)果分辨
若以上異常菌體為革蘭呈陽性梭菌，有或無橢圓狀或球型的芽胞。酶活性實驗呈陰性，判供試IQC出梭菌，不然判供樣品未驗出梭菌。
8 常見問題
8.1 實際操作時勿損害肌膚，若有損害，應(yīng)該馬上注入破傷風(fēng)針抗毒素，防止感柒。
8.2 凡含有活菌及內(nèi)毒素的器材，應(yīng)在完全殺菌后才可清洗。
（七）白色念珠菌
1 概述
白色念珠菌（Candida albicans）別名白假絲酵母菌（Saccharomyces albicaus）屬假絲酵母菌屬（Saccharomyces）。白色念珠茵是條件致病菌，是醫(yī)藥學(xué)全身病菌感染病的關(guān)鍵構(gòu)成之一，一旦感柒，?？稍斐尚膬?nèi)膜炎、肺部感染、紅屁屁、嬰兒鵝口瘡、陰道炎癥、心肌炎及敗血病等。
白色念珠菌菌體細(xì)胞正圓形或橢圓狀，直徑為3～6um，革蘭氏染色為呈陽性，但菌體上色不勻稱，以發(fā)芽方法繁育，在適合的培養(yǎng)液上面有芽生胞子及假真菌生長發(fā)育，在假真菌間其尾端產(chǎn)生厚膜胞子。白色念珠菌具備β-氟苯半乳甘酶，可降解性NGL，使對一硝基苯酚分散，在偏堿標(biāo)準(zhǔn)下著色。
白色念珠菌普遍遍布于土壤層、水和空氣中，現(xiàn)階段世界各國的藥物、食品安全標(biāo)準(zhǔn)已把白色念珠菌做為微生物檢驗中酵母的意味著菌，因而有一些藥物根據(jù)給藥途徑和制劑將白色念珠菌做為操縱菌是十分必需的。
2 實驗器械及標(biāo)準(zhǔn)
2.1 機器設(shè)備及容器
生化培養(yǎng)箱（23～28℃）、恒溫培養(yǎng)箱（30～35℃）、水浴鍋、光學(xué)顯微鏡、三角燒瓶、塑料吸管、細(xì)胞培養(yǎng)皿等。
2.2 規(guī)范菌種
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]。
菌液制取 取新鮮白色念珠菌菌苗打疫苗至10ml沙氏葡萄糖水液體培養(yǎng)基中，30～35℃塑造24～兩天，用0.9％無菌檢測鹽水稀釋液至含菌10～100cfu／ml。菌液可以用沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液平板電腦記數(shù)測量。
2.3 培養(yǎng)液
沙氏葡萄糖水液體培養(yǎng)基（配件二5.35）
沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.36）
滴蟲著色培養(yǎng)液（荷蘭CHROMAGAR企業(yè)）[配件二5.37]
1％聚山梨酯80－玉米面粉瓊脂培養(yǎng)液（配件二5.38）
3 實驗實際操作
取供標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml（等同于供試品1g、1ml、10cm2）立即或解決后打疫苗至適當(dāng)（不少于100m1）的沙氏葡萄糖水骨頭湯培養(yǎng)液中，塑造24～48 h。取以上塑造物畫線打疫苗于沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液平板電腦上，經(jīng)30～35℃，塑造24～48h（必需時增加至72h）。
白色念珠菌在沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液上生長發(fā)育的菌體呈奶白色少許淺黃色，表層光潔有濃酵母菌味道，塑造時間稍久則菌體擴大，色調(diào)變深、材質(zhì)發(fā)硬或者有皺摺。
若平板電腦上無菌檢測落生長發(fā)育或生長發(fā)育的菌體與以上菌體形狀特點不符合，判供樣品未驗出白色念珠菌。
如平板電腦上生長發(fā)育的菌體與以上菌體形狀特點相符合或疑是，應(yīng)選擇2～3個菌體各自打疫苗至滴蟲著色培養(yǎng)液平板電腦上，經(jīng)30～35℃塑造24～48h（必需時增加至72h）。若平板電腦上無翠綠色或綠色的菌體生長發(fā)育，判供樣品未驗出白色念珠菌。
4 確定實驗
若平板電腦上生長發(fā)育的菌體為翠綠色或綠色，挑取相符合或疑是的菌體打疫苗于1％聚山梨酯80－苞米瓊脂培養(yǎng)液上，塑造24～48h。取塑造物開展上色，鏡檢查及芽管實驗。
芽管實驗 挑取1％聚山梨酯80－苞米瓊脂培養(yǎng)液上的塑造物，打疫苗于加上一滴血清蛋白的蓋玻片上，蓋上蓋玻片，置潮濕的平皿內(nèi)，置35～37℃塑造1～3h，置顯微鏡下觀查，可看到由胞子長出簡短芽管。
若以上疑是菌為非革蘭陽性菌，光學(xué)顯微鏡末見厚膜胞子、假真菌、芽管，判供樣品未驗出白色念珠菌。
三、培養(yǎng)液適用范圍查驗
1 簡述
培養(yǎng)液品質(zhì)是危害微生物檢驗結(jié)果的關(guān)鍵步驟。記數(shù)測量用培養(yǎng)液的促生長發(fā)育工作能力是微生物限度查驗結(jié)果分辨的關(guān)鍵影響因素，操縱菌查驗用培養(yǎng)液也很有可能因為其促生長發(fā)育工作能力、標(biāo)示工作能力、抑止工作能力的差別，進(jìn)而對菌體色調(diào)、形狀等指標(biāo)值存有很大差別，危害結(jié)果分辨的普遍性。
培養(yǎng)液適用范圍查驗是根據(jù)檢測用培養(yǎng)液與對比培養(yǎng)液的較為，以陽性菌的生長發(fā)育情況或特點來點評分辨檢測用培養(yǎng)液是不是合乎檢測規(guī)定。
微生物限度查驗用培養(yǎng)液關(guān)鍵分成病菌、黃曲霉菌及酵母菌計數(shù)測量用培養(yǎng)液和操縱菌查驗用培養(yǎng)液兩一部分。2010版《中國藥典》微生物限度檢測法中載于了“適用范圍查驗”對培養(yǎng)液品質(zhì)開展操縱。
2 培養(yǎng)液適用范圍查驗試驗的一般規(guī)定
2.1 培養(yǎng)液適用范圍查驗應(yīng)用領(lǐng)域
2010版《中國藥典》要求微生物限度查驗中制成品培養(yǎng)液、由脫干培養(yǎng)液或按藥方配置的培養(yǎng)液均應(yīng)開展培養(yǎng)液適用范圍查驗。
培養(yǎng)液適用范圍查驗實驗可用以明確試驗室所應(yīng)用培養(yǎng)液（包含購買的不一樣生產(chǎn)批號的制成品培養(yǎng)液、不一樣生產(chǎn)批號的脫干培養(yǎng)液粉劑、按藥方自主配置培養(yǎng)液常用不一樣批號的原料等）、制取程序流程（包含水體操縱、配置方式、殺菌程序流程等）、儲存標(biāo)準(zhǔn)（溫度、環(huán)境濕度、時間及盛放培養(yǎng)液的器皿標(biāo)準(zhǔn)等）等是不是達(dá)到微生物限度查驗用規(guī)定。即以上危害培養(yǎng)液品質(zhì)的各關(guān)鍵環(huán)節(jié)應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液適用范圍查驗實驗明確，假如在其中有任一基準(zhǔn)點產(chǎn)生變化應(yīng)再次開展培養(yǎng)液適用范圍查驗?？墒俏：ε囵B(yǎng)液品質(zhì)的重要基準(zhǔn)點的轉(zhuǎn)變 應(yīng)把握在微生物菌種試驗室質(zhì)量管理的一般標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)（見2.2），超出一般標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)液是不是還能達(dá)到微生物限度查驗用，沒法根據(jù)培養(yǎng)液適用范圍查驗明確。
當(dāng)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)異常，或試驗室質(zhì)量管理必須，也可根據(jù)培養(yǎng)液適用范圍查驗出示一定根據(jù)。
總而言之，培養(yǎng)液適用范圍查驗是在一切正常標(biāo)準(zhǔn)下有關(guān)培養(yǎng)液品質(zhì)的試驗室控制方法，并不一定在每一次實際的微生物限度查驗試品檢驗實驗主題活動上都務(wù)必另外開展培養(yǎng)液適用范圍查驗實驗，但每一次微生物菌種查驗常用培養(yǎng)液均應(yīng)歷經(jīng)適用范圍查驗。
2.2 微生物限度查驗用培養(yǎng)液質(zhì)量管理的一般標(biāo)準(zhǔn)
2.2.1 不一樣藥方培養(yǎng)液的取代應(yīng)用不可以根據(jù)培養(yǎng)液適用范圍實驗簡易明確。
2.2.2 培養(yǎng)液適用范圍查驗不可以替代經(jīng)銷商或別的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定對培養(yǎng)液的有效期限、儲存標(biāo)準(zhǔn)、制取方式等的更嚴(yán)苛的要求。
2.2.3 要是沒有獨特要求，培養(yǎng)液配置選用純凈水或純水系統(tǒng)均可，但應(yīng)選用一定對策多方面檢驗操縱，如純凈水應(yīng)核查pH是不是為5～7；選用離子交換制取的純水系統(tǒng)，阻值應(yīng)不小于2MΩ等。
2.2.4 盡可能臨用現(xiàn)配。培養(yǎng)基滅菌后在能取下的前提條件下，盡早取下，切勿在壓力鍋內(nèi)留宿留存；固態(tài)培養(yǎng)基滅菌或溶化后，溶化情況置放不可超出8h；一般預(yù)制構(gòu)件培養(yǎng)液可置清潔自然環(huán)境2～25℃儲存，但不可超出二十一天；固態(tài)瓊脂培養(yǎng)液熔融再應(yīng)用應(yīng)不超過一次。
2.2.5 粉劑培養(yǎng)液或培養(yǎng)液原材料霉變不可再用；預(yù)制構(gòu)件培養(yǎng)液存儲全過程中發(fā)覺混濁、掉色、長菌、比較嚴(yán)重脫干等轉(zhuǎn)變 不可再用。
2.3 對比培養(yǎng)液
對比培養(yǎng)液應(yīng)根據(jù)嚴(yán)苛的品質(zhì)科學(xué)研究和操縱，具有特性平穩(wěn)、品質(zhì)出色的特性。對比培養(yǎng)液做為一種規(guī)范實驗試劑，應(yīng)具有靠譜的來源于和品質(zhì)確保。
2.4 培養(yǎng)液適用范圍查驗指標(biāo)值及常見方式
2.4.1 查驗指標(biāo)值：促生長發(fā)育工作能力、標(biāo)示工作能力、抑止工作能力。
2.4.2 常見方式：立即打疫苗法、澆碟法、表層打疫苗法（施膠法）。
2.4.3 液體培養(yǎng)基一般 選用立即打疫苗測定方法以上3種指標(biāo)值，打疫苗時要留意接種量不可超出培養(yǎng)液容積的10％。固體培養(yǎng)基選用澆碟法和表層打疫苗測定方法以上指標(biāo)值。選用澆碟法調(diào)查固體培養(yǎng)基時，為了更好地確保抽樣的平行面性，平行測定兩皿求平均數(shù)；選用表層打疫苗法（施膠法）調(diào)查固體培養(yǎng)基時，表層打疫苗菌液不超過0.2ml／皿，盡可能操縱在0.1ml／皿，確保抽樣間的平行面性，平行測定兩皿觀查結(jié)果。
3 記數(shù)培養(yǎng)液的適用范圍查驗
微生物限度查驗中記數(shù)用培養(yǎng)液有3種，營養(yǎng)成分瓊脂、玫紅鈉瓊脂和酵母菌浸取粉葡萄糖水瓊脂。
3.1 記數(shù)培養(yǎng)液適用范圍查驗實驗用菌種
大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]
橙黃色鏈球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26003]
枯草枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]
白色念珠茵（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]
黑曲霉菌（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98003]
菌種的塑造及菌液制取同微生物限度查驗方式認(rèn)證。
3.2 實驗過程
3.2.1 培養(yǎng)液制取按照規(guī)定程序流程新鮮配置營養(yǎng)成分瓊脂（被檢培養(yǎng)液和對比培養(yǎng)液）、玫紅鈉瓊脂（被檢培養(yǎng)液和對比培養(yǎng)液）及其酵母菌浸取粉胨葡萄糖水瓊脂（被檢培養(yǎng)液和對比培養(yǎng)液），殺菌儲備用。
3.2.2 營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液取七個無菌檢測平皿，各自打疫苗大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、枯草枯草芽孢菌各2皿，每皿打疫苗1ml菌液（含菌50～100cfu），另一平皿不打疫苗菌做為空白試驗，竭盡對比營養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液，攪拌，凝結(jié)后于30～35℃顛倒塑造48h，記數(shù)；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。
3.2.3 玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液取五個無菌檢測平皿，各自打疫苗白色念珠菌、黑曲霉菌各2皿；每皿打疫苗1ml菌液（含菌50～100cfu)，另一平皿不打疫苗菌做為空白試驗，竭盡對比玫紅鈉瓊脂培養(yǎng)液，攪拌，凝結(jié)后于顛倒塑造72h，記數(shù)；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。
3.2.4 酵母菌浸取粉胨葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液取3個無菌檢測平皿，各自打疫苗白色念珠菌2皿，每皿打疫苗1ml菌液（含菌50～100cfu），另一平皿不打疫苗菌做為空白試驗，竭盡對比酵母菌浸取粉胨葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液，攪拌，凝結(jié)后顛倒塑造72h，記數(shù)；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。
3.3 結(jié)果分辨
若被檢培養(yǎng)液上的菌體平均值不小于對比培養(yǎng)液上的菌體平均值的70％，且菌體形狀、尺寸應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致，則分辨該培養(yǎng)液的適用范圍查驗符合要求。
4 操縱菌查驗用培養(yǎng)液適用范圍查驗
操縱菌查驗用制成品培養(yǎng)液、由脫干培養(yǎng)液或按培養(yǎng)液藥方配備的培養(yǎng)液均應(yīng)查驗。檢查項目包含培養(yǎng)液的促生長發(fā)育、標(biāo)示和抑止特點工作能力。
4.1 記數(shù)培養(yǎng)液適用范圍查驗實驗用菌種
大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]
橙黃色鏈球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26003]
乙型肝炎副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B) 50094]
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B) 10104]
生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B) 64941]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]
菌種的塑造及菌液制取同微生物限度查驗方式認(rèn)證。
4.2 各種各樣培養(yǎng)液必須檢測的工作能力及分辨指標(biāo)值
液體培養(yǎng)基促生長發(fā)育工作能力查驗：取不超100cfu的實驗菌各自打疫苗于被檢培養(yǎng)液和對比培養(yǎng)液中，在相對應(yīng)操縱菌查驗要求的塑造溫度（30～35℃）及最短培養(yǎng)液時間下塑造。增菌培養(yǎng)液多見回應(yīng)液體培養(yǎng)基，與對比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實驗菌應(yīng)生長發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁。
固體培養(yǎng)基促生長發(fā)育工作能力查驗：取實驗菌液0.1ml（含菌數(shù)50～100cfu）各自施膠于被檢培養(yǎng)液和對比培養(yǎng)液上，在相對應(yīng)操縱菌查驗要求的塑造溫度（30～35℃）及最短培養(yǎng)液時間下塑造。
與對比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液與對比培養(yǎng)液上生長發(fā)育的菌體尺寸、形狀特點應(yīng)一致。
液體培養(yǎng)基標(biāo)示工作能力查驗：取不超100cfu的實驗菌各自打疫苗于被檢培養(yǎng)液和對比培養(yǎng)液中，在相對應(yīng)操縱菌查驗要求的塑造溫度（30～35℃）及最短培養(yǎng)液時間下塑造。與對比培養(yǎng)液管較為，被檢培養(yǎng)液中實驗菌應(yīng)生長發(fā)育狀況／顯色劑反映等應(yīng)與對比培養(yǎng)液一致。
固態(tài)養(yǎng)基標(biāo)示工作能力查驗：取實驗菌液0.1ml（含菌不超100cfu）各自施膠于被檢培養(yǎng)液和對比培養(yǎng)液上，在相對應(yīng)操縱菌查驗要求的塑造溫度（30～35℃）及培養(yǎng)液時間下塑造。被檢培養(yǎng)液上實驗菌的茵落形狀特點、菌體色調(diào)及顯色劑反映狀況應(yīng)與對比培養(yǎng)液一致。
培養(yǎng)液抑止工作能力查驗：取不超100cfu的實驗菌各自打疫苗于液態(tài)被檢培養(yǎng)液和對比培養(yǎng)液，取實驗菌0.1ml液（不超100cfu）各自施膠于固態(tài)被檢培養(yǎng)液和對比培養(yǎng)液，在相對應(yīng)操縱菌查驗要求的塑造溫度（30～35℃）及最多培養(yǎng)液時間下塑造，實驗菌應(yīng)不可生長發(fā)育。
4.3 操縱菌查驗用培養(yǎng)液能力測評目錄（表7）
操縱菌查驗涉及到的21種培養(yǎng)液，特性各不相同。報表中簡述培養(yǎng)液查驗的實際新項目，實際操作流程在之后表明。
表7 操縱菌查驗用培養(yǎng)液適用范圍檢查項目、菌種及分辨指標(biāo)值
| 培養(yǎng)液 |
檢測菌種 |
檢測特點 |
檢測指標(biāo)值 |
| 膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液 |
大腸埃希菌 |
促生長發(fā)育工作能力 |
混濁 |
| 銅綠假單胞菌 |
混濁 |
||
| 橙黃色鏈球菌 |
抑止工作能力 |
末見混濁 |
|
| MUG培養(yǎng)液 |
大腸埃希菌 |
促生長發(fā)育工作能力 |
混濁 |
| 大腸埃希菌 |
標(biāo)示工作能力 |
366nm有瑩光 |
|
| 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 或麥康凱瓊脂 |
大腸埃希菌 |
促生長發(fā)育工作能力 |
利用率 |
| 乙型肝炎副傷寒沙門菌 |
利用率 |
||
| 大腸埃希菌 |
標(biāo)示工作能力 |
色調(diào)形狀同對比 |
|
| 乙型肝炎副傷寒沙門菌 |
色調(diào)形狀同對比 |
||
| 乳清蛋白膽鹽發(fā)醇管 |
大腸埃希菌 |
促生長發(fā)育工作能力 |
混濁脹氣 |
| 橙黃色鏈球菌 |
抑止工作能力 |
末見混濁 |
|
| 乳清蛋白發(fā)醇培養(yǎng)液 |
大腸埃希菌 |
促生長發(fā)育工作能力 |
混濁 |
| 大腸埃希菌 |
標(biāo)示能力 |
脹氣 |
|
| 營養(yǎng)成分骨頭湯 |
乙型肝炎副傷寒沙門菌 |
促生長能力 |
混濁 |
| 橙黃色鏈球菌 |
促生長能力 |
混濁 |
|
| 四硫磺粉酸鈉緩釋片亮綠培養(yǎng)液 |
乙型肝炎副傷寒沙門菌 |
促生長能力 |
上清混濁 |
| 橙黃色鏈球菌 |
抑止能力 |
上清末見混濁 |
|
| 膽鹽硫乳瓊脂 或沙門、志賀屬瓊脂 |
乙型肝炎副傷寒沙門菌 |
促生長能力 |
回收率 |
| 乙型肝炎副傷寒沙門菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對比 |
|
| 溴化十六烷基三甲銨 瓊脂 |
銅綠假單胞菌 |
促生長能力 |
回收率 |
| 大腸埃希菌 |
抑止能力 |
不可生長 |
|
| 綠膿菌素測量用培養(yǎng)液 |
銅綠假單胞菌 |
促生長能力 |
回收率 |
| 銅綠假單胞菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對比 |
|
| 亞碲磷酸鹽骨頭湯培養(yǎng)液 |
橙黃色鏈球菌 |
促生長能力 |
混濁 |
| 大腸埃希菌 |
抑止能力 |
末見混濁 |
|
| 卵黃氧化鈉瓊脂或 甘露醇氧化鈉瓊脂 |
橙黃色鏈球菌 |
促生長能力 |
回收率 |
| 橙黃色鏈球菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對比 |
|
| 大腸埃希菌 |
抑止能力 |
不可生長 |
| 培養(yǎng)液 |
檢測菌種 |
檢測特點 |
檢測指標(biāo)值 |
| 梭菌增菌培養(yǎng)液 |
生孢梭菌 |
促生長能力 |
混濁 |
| 澳大利亞瓊脂 |
生孢梭菌 |
促生長能力 |
回收率 |
| 沙氏葡萄糖水骨頭湯 |
白色念珠菌 |
促生長能力 |
混濁 |
| 沙氏葡萄糖水瓊脂 |
白色念珠菌 |
促生長能力 |
回收率 |
| 白色念珠菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對比 |
|
| 滴蟲著色培養(yǎng)液 |
白色念珠菌 |
促生長能力 |
回收率 |
| 白色念珠菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對比 |
|
| 白色念珠菌 |
抑止能力 |
不可生長 |
|
| 1％聚山梨醋80-苞米 瓊脂塑造物 |
白色念珠菌 |
促生長能力 |
回收率 |
| 白色念珠菌 |
標(biāo)示能力 |
顏色形狀同對比 |
4.4 各操縱菌查驗用培養(yǎng)液適用范圍查驗實驗過程
操縱菌查驗用培養(yǎng)液總數(shù)較多，特性不盡相同。為了更好地防止培養(yǎng)液配置全過程發(fā)生忽略，這里特別提醒下列好多個必須獨特注意到培養(yǎng)液：
不能高壓滅菌只有加溫?zé)_殺菌的培養(yǎng)液3種：DHL瓊脂、SS瓊脂和滴蟲著色培養(yǎng)液；
必須加上實驗試劑的培養(yǎng)液3種：TTB培養(yǎng)液、亞碲磷酸鹽骨頭湯和澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液。
下列描述各培養(yǎng)液適用范圍查驗的具體步驟全過程：
4.4.1 膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液 新鮮配置100ml／瓶的對比膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液4瓶，121℃殺菌15min。預(yù)留。各自打疫苗大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及其橙黃色鏈球菌各1瓶，打疫苗菌液量1ml（不超100cfu），另一瓶不打疫苗菌做為空白試驗；被檢培養(yǎng)液同法實際操作，置要求溫度塑造。塑造18鐘頭，與對比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實驗菌應(yīng)生長優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁；塑造兩天，空缺塑造瓶和打疫苗橙黃色鏈球菌的塑造瓶應(yīng)不可混濁；
4.4.2 MUG培養(yǎng)液新鮮配置5ml／支的對比MUG培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，預(yù)留。取3支，打疫苗大腸埃希菌2支，打疫苗菌液0.2ml（不超100cfu），另一支不打疫苗菌做為空白試驗，塑造5鐘頭。在366nm紫外線燈下觀查結(jié)果；被檢培養(yǎng)液同法實際操作，置要求溫度塑造?？杖彼茉旃軕?yīng)不可混濁，且366nm處觀查無瑩光；與對比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實驗菌應(yīng)生長優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁，366nm處要展現(xiàn)瑩光。若瑩光不顯著，則能延長至24小時觀查。
4.4.3 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)液（EMB） 新鮮配置對比EMB瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。取五個無菌檢測EMB瓊脂平板電腦，各自施膠打疫苗大腸埃希菌和乙型肝炎副傷寒沙門菌各2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。塑造18h，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點及顏色應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造24小時，空缺平板電腦應(yīng)無菌檢測落生長。
4.4.4 麥康凱瓊脂培養(yǎng)液 新鮮配置對比麥康凱瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。取五個無菌檢測麥康凱瓊脂平板電腦，各自施膠打疫苗大腸埃希菌和乙型肝炎副傷寒沙門菌各5皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。塑造18鐘頭，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點及顏色應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造24小時，空缺平板電腦應(yīng)無菌檢測落生長。
4.4.5 乳清蛋白膽鹽發(fā)醇培養(yǎng)液 新鮮配置十米／支的對比膽鹽乳清蛋白培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，預(yù)留。取5支，各自打疫苗大腸埃希菌和橙黃色鏈球菌，各2支，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一支不打疫苗菌做為空白試驗；被檢培養(yǎng)液同法實際操作，置要求溫度塑造。塑造18h，與對比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實驗菌應(yīng)生長優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基掉色、混濁，且倒管內(nèi)應(yīng)該有顯著的脹氣狀況；塑造24小時，空缺塑造管和打疫苗橙黃色鏈球菌的塑造管應(yīng)不可掉色、不可混濁。
4.4.6 乳清蛋白發(fā)醇培養(yǎng)液 新鮮配置10ml／支的對比乳清蛋白發(fā)醇培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，預(yù)留。取3支，打疫苗大腸埃希菌2支，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一支不打疫苗菌做為空白試驗；被檢培養(yǎng)液同法實際操作，置要求溫度塑造。塑造18h，與對比培養(yǎng)液較為．被檢培養(yǎng)液中實驗菌應(yīng)生長發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基掉色、混濁，且有軟管中應(yīng)該有顯著的脹氣狀況；塑造24小時，空缺塑造管應(yīng)不可掉色、不可混濁。
4.4.7 營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液 新鮮配置100ml／瓶的對比營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液3瓶，121℃殺菌15min，預(yù)留。各自打疫苗乙型肝炎副傷寒沙門菌和橙黃色鏈球菌各1瓶，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一瓶不打疫苗菌種做為空白試驗；被檢培養(yǎng)液同法實際操作，置要求溫度塑造。塑造18h，與對比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實驗菌應(yīng)生長發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁；塑造48h，空缺塑造瓶應(yīng)不可混濁。
4.4.8 四硫磺粉酸鈉緩釋片亮綠培養(yǎng)液（TTB） 新鮮配置10ml／支的對比TTB培養(yǎng)液基本，121℃殺菌15min，預(yù)留。臨用前，無菌操作原則添加0.2ml碘標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.lml亮綠標(biāo)準(zhǔn)溶液。取5支，各自打疫苗乙型肝炎副傷寒沙門菌和橙黃色鏈球菌各2支，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一支不打疫苗菌做為空白試驗；被檢培養(yǎng)液同法實際操作，置要求溫度塑造。塑造18h，與對比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實驗菌應(yīng)生長發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基上清混濁；塑造24小時，空缺的塑造管和打疫苗橙黃色鏈球菌的塑造管應(yīng)不可混濁。
因為TTB中的碳酸氫鈣對混濁狀況觀查有影響，因而若混濁狀況不顯著，則將各塑造物打疫苗至膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門、志賀屬瓊脂（SS）平板電腦上劃線觀查TTB塑造物生長發(fā)育狀況，空白試驗和打疫苗橙黃色鏈球菌的塑造管畫線后應(yīng)無菌檢測落生長發(fā)育，對比和被檢TTB培養(yǎng)液畫線打疫苗至瓊脂平板電腦后應(yīng)該有菌體生長發(fā)育，且色調(diào)形狀一致。
4.4.9 膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)液（DHL） 新鮮配置對比DHL瓊脂培養(yǎng)液，加溫充足融解，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。取3個無菌檢測DHL瓊脂平板電腦，施膠打疫苗乙型肝炎副傷寒沙門菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。塑造18h，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點及色調(diào)應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造48h，空缺平板電腦應(yīng)無菌檢測落生長發(fā)育。
4.4.10 沙門、志賀屬瓊脂培養(yǎng)液（SS） 新鮮配置對比SS瓊脂培養(yǎng)液，加溫充足融解，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。取3個無菌檢測SS瓊脂平板電腦，施膠打疫苗乙型肝炎副傷寒沙門菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。塑造18h，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點及色調(diào)應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造48h，空缺平板電腦應(yīng)無菌檢測落生長發(fā)育。
4.4.11 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)液基本 新鮮配置對比溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。取七個無菌檢測瓊脂平板電腦，各自施膠打疫苗銅綠假單胞菌和大腸埃希菌各3皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。塑造18h，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點及色調(diào)應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造24小時，空缺平板電腦和打疫苗大腸埃希菌的平板電腦應(yīng)無菌檢測落生長發(fā)育。
4.4.12 綠膿菌素測量用培養(yǎng)液（PDP） 新鮮配置對比綠膿菌素測量用培養(yǎng)液基本，每升培養(yǎng)液中添加10ml凡士林，121℃殺菌15min，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。取3個無菌檢測綠膿菌素測量用瓊脂平板電腦，施膠打疫苗銅綠假單胞菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后于要求溫度顛倒塑造24小時；被檢培養(yǎng)液同法實際操作?？杖逼桨咫娔X應(yīng)無菌檢測落生長發(fā)育，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點及色調(diào)應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致。
4.4.13 亞碲磷酸鹽骨頭湯培養(yǎng)液 新鮮配置100ml／瓶的對比營養(yǎng)成分骨頭湯培養(yǎng)液3瓶，121℃殺菌15min，預(yù)留。臨用添加新鮮配置的無菌檢測1％亞碲磷酸鹽0.2ml。各自打疫苗橙黃色鏈球菌和大腸埃希菌各1瓶，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一瓶不打疫苗菌種做為空白試驗；被檢培養(yǎng)液同法實際操作，置要求溫度塑造。塑造18h，與對比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實驗菌應(yīng)生長發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基發(fā)黑、變混濁；塑造48h，空缺塑造瓶和打疫苗大腸埃希菌的塑造瓶應(yīng)不可混濁。
4.4.14 卵黃氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液新鮮配置對比卵黃氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液基本，121℃殺菌15min，制冷至60℃，參考2010版《中國藥典》占比無菌操作原則添加10％氧化鈉卵黃液，充足振搖后竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。取五個無菌檢測瓊脂平板電腦，各自施膠打疫苗橙黃色鏈球菌和大腸埃希菌各2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。塑造24小時，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點及色調(diào)應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造72h，空缺平板電腦和打疫苗大腸埃希菌的平板電腦應(yīng)無菌檢測落生長發(fā)育。
4.4.15 甘露醇氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液 新鮮配置對比甘露醇氧化鈉瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。取五個無菌檢測瓊脂平板電腦，各自施膠打疫苗橙黃色鏈球菌和大腸埃希菌各2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～1000fu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。塑造24小時，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點及色調(diào)應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造72h，空缺平板電腦和打疫苗大腸埃希菌的平板電腦應(yīng)無菌檢測落生長發(fā)育。
4.4.16 梭菌增菌培養(yǎng)液 新鮮配置100ml／瓶的對比梭菌增菌培養(yǎng)液2瓶，121℃殺菌15min，預(yù)留。打疫苗生孢梭菌1瓶，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一瓶不打疫苗菌種做為空白試驗，置要求溫度的厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)塑造48h；被檢培養(yǎng)液同法實際操作?？杖彼茉炱繎?yīng)不可混濁；與對比培養(yǎng)液較為，被檢培養(yǎng)液中實驗菌應(yīng)生長發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁。
4.4.17 澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液 新鮮配置對比澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃后竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。取3個澳大利亞瓊脂平板電腦，施膠打疫苗生孢梭菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后置攝像頭要求溫度的厭氧發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)下顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。兩天空缺平板電腦應(yīng)無菌檢測落生長發(fā)育，被檢培養(yǎng)液菌體尺寸、形狀特點應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致。
澳大利亞瓊脂培養(yǎng)液營養(yǎng)豐富，適合大部分需氧菌的生長發(fā)育，為了更好地清除其他霉菌生長發(fā)育對查驗結(jié)果的危害，可在每升殺菌后培養(yǎng)液中按無菌操作原則加上帶有等同于50mg青霉素的鹽酸青霉素。加上青霉素的澳大利亞瓊脂可參考以上方式開展培養(yǎng)液適用范圍調(diào)查。
4.4.18 沙氏葡萄糖水骨頭湯培養(yǎng)液 新鮮配置100ml／瓶的對比沙氏葡萄糖水骨頭湯培養(yǎng)液2瓶，121℃殺菌15min，預(yù)留。打疫苗白色念珠菌1瓶，打疫苗菌液1ml（不超100cfu），另一瓶不打疫苗菌種做為空白試驗；被檢培養(yǎng)液同法實際操作，置要求溫度塑造。塑造48h，與對比培養(yǎng)液較為。被檢培養(yǎng)液中實驗菌應(yīng)生長發(fā)育優(yōu)良，主要表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變混濁；塑造72h，空缺塑造瓶應(yīng)不可混濁。
4.4.19 沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液 新鮮配置對比沙氏葡萄糖水瓊脂培養(yǎng)液，121℃殺菌15min，制冷至60℃后，竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。取3個沙氏葡萄糖水瓊脂平板電腦，施膠打疫苗白色念珠菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。塑造24小時，被檢培養(yǎng)液上的菌體尺寸、形狀特點、色調(diào)及味道應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造72h，空缺平板電腦應(yīng)無菌檢測落生長發(fā)育。
4.4.20 滴蟲著色培養(yǎng)液 新鮮配置對比滴蟲著色培養(yǎng)液，加溫充足融解，制冷至60℃竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。滴蟲著色平板電腦應(yīng)用前遮光儲存，取五個無菌檢測滴蟲著色平板電腦，各自施膠打疫苗白色念珠菌和大腸埃希菌各2皿，打疫苗0.1ml菌液（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。塑造24小時，被檢培養(yǎng)液上的菌體尺寸、形狀特點及色調(diào)應(yīng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造72h，空缺平板電腦和打疫苗大腸埃希菌的平板電腦應(yīng)無菌檢測落生長發(fā)育。
4.4.21 1％聚山梨酯80－苞米瓊脂培養(yǎng)液 新鮮配置對比1％聚山梨酯80－苞米瓊脂培養(yǎng)液基本，每升培養(yǎng)液中添加10ml聚山梨酯80，121℃殺菌15min，制冷至60℃后，竭盡平皿，35℃恒溫箱預(yù)培8h儲備用。取3個1％聚山梨酯80－苞米瓊脂平板電腦，施膠打疫苗白色念珠菌2皿，打疫苗菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板電腦不打疫苗菌做為空白試驗，施膠勻稱后于要求溫度顛倒塑造；被檢培養(yǎng)液同法實際操作。塑造24小時，被檢培養(yǎng)液菌體的尺寸、形狀特點及芽管標(biāo)示工作能力應(yīng)當(dāng)與對比培養(yǎng)液上的菌體一致；塑造48h，空缺平板電腦應(yīng)無菌檢測落生長發(fā)育。
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